细胞色素P4502C9*8与CYP2C9*27慢病毒表达载体的构建及在HEK239T细胞中的稳定表达

• 作者: 万子衿 刘勇 廖凯 李巍
• 来源期刊: 实用临床医药杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 细胞色素P4502C9(CYP2C9) CYP2C9*8 CYP2C9* 27 慢病毒 HEK293T
• 年，卷（期）: 2018,（7）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 1-6
• 页数: 6页
• 分类号: R329.2
• 字数: 3802字
• 语种: 中文
• DOI: 10.7619/jcmp.201807001

摘要

目的 构建人细胞色素P450 2C9(CYP2C9)及突变体CYP2C9*8与CYP2C9* 27的慢病毒表达质粒,并于HEK293T细胞中稳定表达.方法 反转录人肝总RNA获得cDNA,PCR扩增获得CYP2C9编码序列,并克隆至载体MigR1上,获得慢病毒表达重组质粒MigR1-CYP2C9.以该质粒为模板,重叠PCR方法分别引入449G＞A与449G＞T点突变,并分别克隆至MigR1,获得MigR1-CYP2C9*8与MigR1-CYP2C9* 27慢病毒表达质粒.在HEK 293T细胞中进行病毒包装,并采用获得的慢病毒感染HEK293细胞,经流式分选和单克隆挑取获得稳定表达CYP2C9、CYP2C9*8与CYP2C9* 27的细胞,命名为293T-2C9、293T-2C9*8与293T-2C9* 27.实时定量PCR(qRT-PCR)与Western blot检测胞内CYP2C9表达.采用CYP2C9的特异性底物双氯芬酸对CYP2C9的活性进行评价.结果 成功构建MigR1-CYP2C9、MigR1-CYP2C9*8与MigR1-CYP2C9* 27表达载体.采用构建病毒感染获得的单克隆细胞293T-2C9、293T-2C9 * 8与293T-2C9* 27在30代后荧光显微镜下观察可见绿色荧光表达率在100％,qRT-PCR与Western blot均表明有目标分子表达.提取自这三株细胞的微粒体均可催化双氯芬酸代谢为4-羟基双氯芬酸.结论 成功构建稳定表达CYP2C9、CYP2C9*8与CYP2C9* 27人源化细胞模型,该方法构建的细胞可用于CYP2C9*8与*27两个突变体的功能研究.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	刘勇	大连理工大学生命与医药学院	20	93	7.0	9.0
2	李巍	扬州大学医学院	17	17	1.0	3.0
6	廖凯	扬州大学医学院	1	0	0.0	0.0
10	万子衿	扬州大学医学院	1	0	0.0	0.0