含心脏阿霉素反应蛋白基因的重组慢病毒过表达和RNA干扰载体的构建及鉴定

• 作者: KOJIC Snezana 余华军 周霞 李友 梁春梅 汪亚君 温霞 许旭三 马国达
• 来源期刊: 吉林大学学报（医学版）
• 学科: 生物学
• 关键词: 心脏阿霉素反应蛋白 RNA干扰 慢病毒 H9C2细胞
• 年，卷（期）: 2019,（4）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 766-771,前插1
• 页数: 7页
• 分类号: Q78
• 字数: 3241字
• 语种: 中文
• DOI: 10.13481/j.1671-587x.20190404

摘要

目的:构建心脏阿霉素反应蛋白(CARP)基因重组慢病毒过表达和RNA干扰载体并进一步包装慢病毒,为研究CARP在阿霉素(ADR)心肌病中的作用及机制奠定基础.方法:将PCR扩增的大鼠CARP基因序列和设计合成的短发夹RNA(shRNA)序列分别插入GV-358和GV-248表达载体,行DNA测序鉴定.采用重组CARP过表达和shRNA表达穿梭载体与Helper 1.0和Helper 2.0辅助包装质粒共转染人胚肾细胞HEK293T,进行病毒包装和扩增,采用终点稀释法测定病毒滴度.采用重组慢病毒感染HEK293T细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度.采用重组慢病毒感染H9C2细胞,分为对照组、Scramble RNA组、CARP过表达组和shRNA CARP组,Western blotting法检测各组细胞中CARP蛋白表达水平.结果:基因测序,CARP过表达及shRNA载体序列与原设计序列完全相符.载体转染HEK293T细胞后,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达.包装的CARP过表达及shRNA病毒感染H9C2细胞后,与对照组比较,CARP过表达组细胞中CARP蛋白表达水平升高5.3倍(P=0.01),shRNA CARP组细胞中CARP蛋白表达水平降低53％(P=0.02).结论:成功构建了CARP过表达和特异性shRNA慢病毒表达载体并获得高感染效率的过表达和RNA干扰慢病毒,后者在H9C2细胞中能够干预CARP表达.