基于CRISPR/Cas9技术的HaCaT的TLR4基因定向敲除及其功能初步研究

• 作者: 何颖 孟繁梅 李碧舟 艾云灿 邹泽红 陶爱林 黄瑜烨
• 来源期刊: 生物技术
• 学科: 生物学
• 关键词: CRISPR/Cas9系统 TLR4基因 基因敲除 HaCaT细胞株
• 年，卷（期）: 2019,（1）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 57-62,102
• 页数: 7页
• 分类号: Q789
• 语种: 中文
• DOI: 10.16519/j.cnki.1004-311x.2019.01.0011

摘要

[目的]构建敲除Toll Like Receptor4(TLR4)基因的HaCaT细胞株,为后续利用该细胞株进行过敏原性研究提供材料.[方法]利用CRISPR/Cas9系统,根据靶向原理设计并合成4条特异性识别TLR4基因的向导RNA(single-molecule guide RNAs,sgRNAs),构建pX459-sgRNAhTLR4重组质粒,并转入HaCaT中,用嘌呤霉素筛选出单克隆阳性细胞.测序确认突变位点,然后利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激对TLR4进行功能验证来进一步确认敲除效果.[结果]测序结果表明#26单克隆细胞株在靶点附近缺失1 bp,造成TLR4编码基因的移码突变,蛋白翻译提前终止.功能性验证结果表明,在LPS的刺激下,IL-8和CCL20的mRNA水平分别下降约85％和90％,且IL-8的蛋白分泌水平也显著性下调(87％).[结论]成功构建了敲除TLR4的稳定细胞株,并且验证TLR4的功能缺损.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	孟繁梅		16	53	4.0	7.0
2	艾云灿		19	79	4.0	8.0
3	何颖		4	68	2.0	4.0
4	黄瑜烨		1	0	0.0	0.0
5	李碧舟		1	0	0.0	0.0
6	邹泽红		1	0	0.0	0.0
7	陶爱林		1	0	0.0	0.0