基于Tet-On系统构建Alb启动子调控猪uPA转基因表达的慢病毒载体

• 作者: 刘宇 林晓琳 温悦婷 肖东 贾俊双 陈恒伟
• 来源期刊: 中国比较医学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: Alb启动子 小型猪uPA copGFP Tet-On基因表达调控系统 慢病毒载体
• 年，卷（期）: 2019,（5）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 23-28
• 页数: 6页
• 分类号: R-33
• 字数: 3568字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1671-7856.2019.05.004

摘要

目的 应用Tet-On基因表达调控系统构建Alb启动子调控小型猪uPA(pig urokinase-type plasminogen activator,puPA)基因表达的慢病毒载体pLVX-Alb-TetOne-TRE-puPA-T2A-CopGFP(pLATTPUTG).方法 首先将pAlb-Cre-GH/BS作为模板,PCR扩增目的基因Alb-enhancer/promoter,In-Fusion克隆至Xho I/Xba I双酶切的pLVX-TetOne中,获得Alb启动子替换pLVX-TetOne原有的PGK启动子的质粒pLVX-Alb-TetOne;接着以pCD823 A-1为模板,PCR扩增T2A-CopGFP,In-Fusion克隆至BamH I/Age I酶切的pLVX-Alb-TetOne中,获得pLVX-Alb-TetOne-TRE-T2A-CopGFP(pLATTTG);最后以H8803为模板,PCR扩增puPA(3′端含Flag标签),In-Fusion克隆至pLATTTG中,最终获得慢病毒载体pLVX-Alb-TetOne-TRE-puPA-T2A-CopGFP(pLATTPUTG);所构建的质粒均经酶切和测序鉴定.pLATTPUTG瞬转293T细胞,转染24 h后倒置荧光显微镜检测绿色荧光;随后六孔板内加入强力霉素(Dox),48 h后倒置荧光显微镜下检测CopGFP表达(包括未加Dox的孔),接着收集细胞以抽提总RNA和总蛋白,以用于qRT-PCR检测puPA和CopGFP表达及Western blot检测Flag表达.结果 酶切鉴定和测序证实成功构建了慢病毒载体pLATTPUTG.pLATTPUTG转染293T细胞,24 h后倒置荧光显微镜下未见绿色荧光,而加入Dox 48 h后几乎所有细胞均发强的绿色荧光,而不加Dox的孔内仍然未见绿色荧光;加Dox的孔内细胞上puPA、CopGFP和Flag表达水平均显著升高,而不加Dox的孔内细胞上检测到上述基因极低表达;以上数据提示,应用该Tet-On基因表达调控系统实现了puPA基因在293T细胞上可诱导性表达.结论 成功基于Tet-On基因表达调控系统构建Alb启动子调控puPA转基因表达的慢病毒载体pLATTPUTG,这为相关后续研究奠定了坚实基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	贾俊双	南方医科大学肿瘤研究所	15	87	4.0	9.0
2	肖东	南方医科大学比较医学研究所暨实验动物中心	29	117	5.0	10.0
6	林晓琳	南方医科大学肿瘤研究所	10	13	2.0	3.0
7	刘宇	南方医科大学比较医学研究所暨实验动物中心	8	28	3.0	5.0
8	陈恒伟	南方医科大学比较医学研究所暨实验动物中心	2	2	1.0	1.0
9	温悦婷	南方医科大学肿瘤研究所	2	2	1.0	1.0