P2X7受体胞外段蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

• 作者: 张云芳 彭效祥 李明萱 罗淑萍 贾丽娜 赵荣兰
• 来源期刊: 中国免疫学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: P2X7R 重组蛋白 克隆 融合表达
• 年，卷（期）: 2019,（19）
• 所属期刊栏目: 免疫学技术与方法
• 页码范围: 2369-2374
• 页数: 6页
• 分类号: R392
• 字数: 4710字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1000-484X.2019.19.012

摘要

目的:克隆嘌呤能离子通道型受体7(P2X7R)胞外段编码序列,体外表达和鉴定重组P2X7R胞外段蛋白.方法:采用德泰生物密码子优化软件MaxCodonTMOptimization Program(V13),对P2X7R胞外段蛋白氨基酸编码序列进行优化并设计PCR扩增引物.采用重叠PCR扩增目标基因,通过限制性酶切位点NdeⅠ和HindⅢ,将P2X7R胞外段编码序列定向插入原核表达载体pET30a(+),构建pET30a-P2X7R重组表达质粒,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3+)表达菌种中,进行融合表达,诱导剂异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达.重组蛋白含6×His纯化标签,亲和层析(Ni-IDA树脂)纯化后,SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot鉴定纯化产物.结果:PCR扩增的P2X7R胞外段蛋白编码序列长度为885 bp,成功构建重组pET30a-P2X7R质粒,并转化至E.coli BL21(DE3+)菌株中.融合型表达的重组蛋白分子量约为34 kD,可被抗His标签单克隆抗体特异性识别.结论:成功克隆P2X7R胞外段蛋白编码序列、诱导表达并纯化了重组P2X7R胞外段蛋白,为今后制备抗人P2 X7 R胞外段蛋白的单克隆抗体奠定了坚实的基础.