TRAIL胞外段基因克隆及其表达与纯化

• 作者: 周海胜 张立新 李克勤 田方 肖凤君
• 来源期刊: 中国免疫学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: TNF相关的凋亡诱导配体 基因克隆 基因表达 蛋白质纯化
• 年，卷（期）: 2002,（7）
• 所属期刊栏目: 分子与细胞免疫学
• 页码范围: 451-453,456
• 页数: 4页
• 分类号: R392
• 字数: 2721字
• 语种: 中文

摘要

目的:克隆TNF相关的诱导凋亡配体胞膜外段基因(the extracellular region of the human TRAIL cDNA,TPAILex),构建表达载体并在大肠杆菌DH5α中高效表达有生物学活性的TRAIL蛋白胞膜外段.方法:抗CD3McAb刺激正常人外周血淋巴细胞,用RT-PCR、巢式-PCR方法从活化的淋巴细胞中获得人TRAIL基因及其胞膜外段cDNA,并克隆到pGEM-T Easy载体中,DNA测序鉴定.将TRAIL的胞膜外段基因插入表达载体pGEX-2T,构建重组表达质粒pGEX/TRAILex,用IPTG诱导表达TRAIL蛋白的胞膜外段,GST-Agarose 4B层析柱纯化GST-TRAILex融合蛋白,Westem-blot鉴定纯化产物.结果:抗CD3 McAb能诱导正常人外周血单个核细胞TRAIL的高表达,成功地克隆了TRAIL胞膜外段基因,构建了重组表达载体pGEX/TRAILex,IPTG诱导后得到高效表达的TRAIL蛋白胞膜外段,经12%SDS-PAGE分析,可观察到一分子量和理论值相符(约54kD)的诱导表达带.Kodak软件分析表面GST-TRAIL胞膜外段融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的28%,进一步分析证实TRAIL蛋白的胞膜外段主要以可溶性的形式表达,用GST-Agarose4B层析柱纯化超声破菌后的上清,每升细菌培养液可得到9.8 mg纯度的95%以上的GST-Tex.Western-blot结果证实54KD的表达带可与鼠抗TRAIL McAb起特异性反应.结论:成功地克隆了人TRAIL基因,并应用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达人TRAIL蛋白的胞膜外段,为进一步研究TRAIL的功能及其在肿瘤生物治疗中的应用奠定了基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	张立新	军事医学科学院附属医院肿瘤分子生物室	25	106	6.0	9.0
2	肖凤君	军事医学科学院附属医院肿瘤分子生物室	18	72	6.0	7.0
3	田方	军事医学科学院附属医院肿瘤分子生物室	15	139	7.0	11.0
4	周海胜	军事医学科学院附属医院肿瘤分子生物室	2	3	1.0	1.0
5	李克勤	军事医学科学院附属医院肿瘤分子生物室	4	32	3.0	4.0