桂糖11号Rubisco基因克隆、原核表达及纯化

• 作者: 吴朝兴 孙波 李杨瑞 杨丽涛 牛俊奇 王露蓉 蒋媛 顾彩彩
• 来源期刊: 南方农业学报
• 关键词: 甘蔗 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco) 克隆 原核表达 融合蛋白 纯化
• 年，卷（期）: 2016,（4）
• 所属期刊栏目: 作物遗传育种·种质资源·分子生物学
• 页码范围: 524-529
• 页数: 6页
• 分类号: S566.1|Q78
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j:issn.2095-1191.2016.04.524

摘要

[目的]通过原核表达及纯化获得甘蔗1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的大、小亚基融合蛋白,为获得符合抗体制备条件的高纯度融合蛋白提供技术支持.[方法]以甘蔗品种桂糖11号(GT11)+1叶为材料,根据NCBI公布的甘蔗Rubisco大、小亚基基因(rbcL和rbcS)的编码域序列(CDS)设计特异性引物,PCR扩增rbcL和rbcS基因的CDS,然后连接至原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒后转入原核细胞(大肠杆菌Rosetta)中诱导表达,用镍亲和层析柱对融合蛋白进行纯化,并比较分析桂糖11号与其他甘蔗品种在rbcL和rbcS基因的CDS及编码蛋白序列方面的差异.[结果]rbcL和rbcS基因的CDS长度分别为1431和510bp,其中桂糖11号rbcL基因的CDS与Saccharumhybrid cultivar SP80-3280(GenBank登录号AE009947)、Saccharum hybrid cultivar Q155(GenBank登录号KU214867)的一致,桂糖11号rbcS基因的CDS与Saccharum hybrid cultivar GT28(GenBank登录号JN591757)的存在7个碱基差异,但仅有2个氨基酸发生错义突变.RbcL和RbcS融合蛋白以包涵体形式存在原核细胞中,用镍离子亲和层析纯化及超滤浓缩后其浓度均在1.0 mg/mL以上.[结论]从桂糖11号成功克隆Rubisco大亚基和小亚基基因的CDS,大亚基基因的CDS比小亚基的保守性更高,且均可在原核细胞中高度表达,经纯化浓缩获得的高纯度融合蛋白可用于制备Rubisco单克隆抗体.