幽门螺杆菌毒力蛋白cagA基因敲除突变株构建及鉴定

• 作者: 周建奖 张晓怡 李抄 王琴容 谢渊 赵艳 陈定宇
• 来源期刊: 贵州医科大学学报
• 学科: 医学
• 关键词: 螺杆菌,幽门 基因打靶 感染 细胞毒性相关蛋白cagA 聚合酶链式反应 电转化
• 年，卷（期）: 2020,（2）
• 所属期刊栏目: 专题研究1
• 页码范围: 125-131
• 页数: 7页
• 分类号: R378
• 字数: 5307字
• 语种: 中文
• DOI: 10.19367/j.cnki.1000-2707.2020.02.001

摘要

目的:构建幽门螺杆菌(Hp)毒力蛋白cagA基因敲除突变株并进行鉴定.方法:采用基因打靶技术,从Hp1004基因组扩增cagA基因的上、下游同源重组臂序列,从pACYC184质粒上扩增氯霉素(Cm)序列,通过融合聚合酶链式反应(PCR)技术获得cagA基因敲除打靶片段,克隆入载体pUCmT,得到打靶载体pUCmT-ΔcagA::Cm;再通过电转化法将pUCmT-ΔcagA::Cm质粒直接转入Hp1004,氯霉素抗性平板筛选cagA基因敲除株并命名为Hp/ΔcagA::Cm;采用PCR进行鉴定,并用Hp/ΔcagA::Cm和Hp/cagA感染原代胃癌细胞,检测胞内cagA的表达和对细胞形态的影响.结果:融合PCR构建打靶片段长度为1794 bp,打靶载体转化Hp并筛选后,用cagA外侧引物PCR扩增Hp/ΔcagA::Cm和野生型Hp/cagA,产物长度分别为2150 bp和5014 bp;Hp/ΔcagA::Cm和Hp/cagA分别感染细胞后,细胞死亡数量多于感染Hp/ΔcagA::Cm突变株,差异有统计学意义(P<0.01);野生型Hp/cagA菌株及其感染细胞内cagA蛋白表达水平较Hp/ΔcagA::Cm突变型菌株及其感染细胞明显降低,差异有统计学意义(P<0.01).结论:成功构建Hp/ΔcagA::Cm突变株,并在感染细胞中得到验证,表明cagA蛋白对细胞有一定的毒性作用.