副溶血弧菌密度感应系统调控exsA和exsD的分子机制

• 作者: 仇越 周冬生 张义全 杜天钰 杨文慧 殷喆 王丽 王迎 王霄 胡凌飞
• 来源期刊: 军事医学
• 学科: 生物学
• 关键词: 副溶血弧菌 密度感应系统 AphA OpaR exsA exsD
• 年，卷（期）: 2020,（10）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 740-745
• 页数: 6页
• 分类号: Q933
• 语种: 中文
• DOI: 10.7644/j.issn.1674-9960.2020.10.005

摘要

目的 研究副溶血弧菌密度感应系统核心调控子AphA和OpaR对exsA和exsD的调控机制.方法 提取野生株(WT)和调控子基因突变株(ΔaphA或ΔopaR)总RNA,采用引物延伸实验确定exsA和exsD的转录起始位点,并根据WT和突变株中引物延伸产物的丰度,判定AphA和OpaR对exsA和exsD的调控关系;将exsA和exsD的启动子区DNA序列克隆入pHRP309质粒无启动子区的β-半乳糖苷酶基因的上游,构建重组质粒,并将其分别转入WT、ΔaphA和ΔopaR中得到LacZ菌株,用β-半乳糖苷酶检测试剂盒检测并比较各LacZ菌株中β-半乳糖苷酶活性的差异来判断AphA和OpaR对exsA和exsD的调控关系;PCR扩增exsA和exsD的上游调控序列,并表达纯化His-AphA和His-OpaR重组蛋白,利用凝胶阻滞实验(EMSA)探究重组蛋白是否可结合到exsA和exsD的上游调控序列上,并采用DNase I足迹实验鉴定具体的结合位点.结果 引物延伸实验结果显示,exsA和exsD各有一个转录起始位点,分别为C(-440)和C(-105)(翻译起始位点为+1),且在低密度生长条件下,AphA可激活它们的转录活性,而在高密度生长条件下,OpaR抑制它们的转录活性,随后的LacZ报告基因融合实验进一步确证了这种调控关系.体外的EMSA和DNaseⅠ足迹实验结果表明,His-AphA和His-OpaR均不能与exsA和exsD启动子DNA序列结合.结论 低密度生长时,AphA间接激活exsA和exsD的转录;高密度生长时,OpaR间接抑制exsA和exsD的转录.