抗弓形虫伴侣蛋白60多克隆抗体制备与鉴定

• 作者: 刘淑贤 曹佳欣 程琳妍 谭峰
• 来源期刊: 温州医科大学学报
• 学科: 医学
• 关键词: 刚地弓形虫 顶质体 伴侣蛋白60 小鼠 多克隆抗体
• 年，卷（期）: 2020,（11）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 861-866
• 页数: 6页
• 分类号: R392
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2020.11.001

摘要

目的:制备、鉴定抗弓形虫伴侣蛋白60(TgCpn60)特异性多克隆抗体.方法:以弓形虫RH株cDNA为模板,PCR扩增编码TgCpn60的C末端168个氨基酸(TgCpn60C168AA)的507 bp序列片段,构建pGEX-4T-1-TgCpn60C168AA重组质粒.将鉴定正确的质粒转化入大肠埃希菌(E.coli)BL21,并利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,进而用Glutathione-SepharoseTM4B介质亲和层析法纯化重组蛋白后行SDS-PAGE电泳.以纯化的GST-TgCpn60C168AA蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取小鼠血清进行纯化,获得特异性抗TgCpn60C168AA多克隆抗体.以该多克隆抗体为一抗,进行Western blot检测,验证其与虫体蛋白的反应情况.瞬时转染pFNR-RFP质粒至虫体后,采用间接免疫荧光法(IFA)检测TgCpn60与弓形虫顶质体外腔膜标志蛋白NADP+铁氧化还原蛋白还原酶(TgFNR)的共定位情况.结果:经PCR及测序结果证实重组质粒pGEX-4T-1-TgCpn60C168AA构建成功.SDS-PAGE电泳结果表明,GST-TgCpn60C168AA蛋白成功诱导表达.Western blot结果显示,制备的多克隆抗体既能特异性识别GST-TgCpn60C168AA重组蛋白,同时也能识别弓形虫内源性TgCpn60蛋白.IFA结果证实,TgCpn60蛋白与TgFNR蛋白存在共定位现象.结论:制备的抗GST-TgCpn60C168AA重组蛋白多克隆抗体能特异性识别弓形虫内源性TgCpn60蛋白,为进一步研究该蛋白功能提供了有利的工具.