基于实时荧光定量PCR技术的当归不同炮制品中金黄色葡萄球菌含量测定方法的开发及比较

• 作者: 严维花 曹虹虹 郭爽 白德涛 陈杰 毛春芹 李林 陆兔林
• 来源期刊: 中国实验方剂学杂志
• 关键词: 当归饮片 炮制品 金黄色葡萄球菌 实时荧光定量聚合酶链式反应法(Real-time PCR) 致病菌 特异性引物 平板计数法
• 年，卷（期）: 2020,（23）
• 所属期刊栏目: 药学基础
• 页码范围: 137-144
• 页数: 8页
• 分类号: R28|R943.1|Q939.5|S852.61
• 语种: 中文
• DOI: 10.13422/j.cnki.syfjx.20201549

摘要

目的:对当归不同炮制品中金黄色葡萄球菌的变化情况进行定量分析.方法:建立了实时荧光定量聚合酶链式反应法(Real-time PCR),对不同产地、不同收集企业、不同储藏时间当归饮片中金黄色葡萄球菌进行定量分析.荧光定量反应体系为SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10μL,正向引物、反向引物(10μmol·L-1)各0.8 μL,模板/基因组DNA 1 μL,双蒸水7.4 μL.荧光定量反应条件为①扩增曲线:94℃预变性30 s,94 ℃变性10s,60 ℃退火12s,72 ℃延伸30s,循环45次,72 ℃单点检测信号;②熔解曲线:72℃开始检测,以0.5℃为台阶温度停留15s采集荧光.根据Real-time PCR的测定结果,分别从生当归、酒当归和土炒当归中选择具有代表性的样品进行平板计数法测定,并与Real-time PCR检测结果进行比较.结果:不同炮制品中金黄色葡萄球菌含量排序为生当归＞土炒当归＞酒当归;在不同产地的当归饮片中均以甘肃渭源地区样品所含的金黄色葡萄球菌含量为最低;与零售企业相比,生产销售企业的生当归和酒当归中金黄色葡萄球菌含量较低;不同储藏时间对生当归和酒当归中金黄色葡萄球菌含量有一定的影响,随储藏时间的增加,金黄色葡萄球菌的含量增加.对部分代表性样品进行检测时发现,平板计数法检测结果数量级较Real-time PCR低3～4个数量级.结论:建立的Real-time PCR的特异性、灵敏度、准确性以及报告周期均优于平板计数法,可为当归不同炮制品中金黄色葡萄球菌的快速、准确定量检测提供有效技术手段.