犬瘟热病毒CDV-3株感染性克隆的构建与鉴定

• 作者: 卜研 闫喜军 赵建军 李海涛 赵传芳 薛向红
• 来源期刊: 生物工程学报
• 关键词: 犬瘟执病毒 CDV-3株 感染性克隆 反向遗传系统
• 年，卷（期）: 2021,（1）
• 所属期刊栏目: 动物及兽医生物技术
• 页码范围: 178-186
• 页数: 9页
• 语种: 中文
• DOI: 10.13345/j.cjb.200248

摘要

以国内商品化水貂犬瘟热病毒疫苗所用毒株CDV-3为模板,构建犬瘟热病毒感染性cDNA克隆,为犬瘟热病毒新型疫苗研制、致病机理研究提供理论基础.设计13对引物对其全基因组序列测定,分析单一酶切位点,将CDV-3的全长分5个片段进行RT-PCR扩增.经酶切拼接,将5个片段顺次插入到酶切位点改造后的真核载体pcDNA3.2的多克隆酶切位点处,同时在Fl首端和F5末端分别加入锤头状核酶和丁型肝炎核酶序列,获得CDV-3株的全长cDNA质粒(pcDNA3.2-CDV-3).构建表达CDV-3 N、P、L蛋白的3个辅助质粒.利用转染试剂LipofectamineTM 2000将全长质粒和3个辅助质粒共转染293T细胞,3d后,将上清接种到Vero细胞.观察犬瘟热病毒典型合胞体病变,对重组病毒进行免疫荧光鉴定和标签鉴定.最后,比较wtCDV-3和rCDV-3的生长特性.全长质粒和辅助质粒的酶切鉴定和序列测序均正确.拯救的重组病毒能在Vero细胞上形成典型的合胞体病变,经RT-PCR、间接免疫荧光和电镜观察鉴定,证明成功拯救出重组病毒rCDV-3株.rCDV-3的病毒滴度最高达到107.667 TCID50/mL,比wtCDV-3的滴度106.667 TCID50/mL高出约10倍.rCDV-3感染Vero细胞后,迅速大量增殖,于感染后36 h达到最高病毒滴度.而wtCDV-3增殖平缓,感染后72 h时病毒含量达到最大.文中建立的高效CDV-3株反向遗传操作平台,为犬瘟热病毒新型疫苗研制和致病机理研究奠定基础.