长链非编码RNA钾电压门控通道亚家族Q成员1重叠转录物1靶向调控miR-92a-1-5p影响胰岛β细胞功能的机制研究

• 作者: 陈亚兰 李晏丽 林倍思 麦晓东 彭粤跃 陈丹蕊 苏燕娜 徐芬 李万根 许雯
• 来源期刊: 中华糖尿病杂志
• 关键词: 糖尿病 胰岛素分泌 长链非编码RNA Kcnq1ot1 miR-92a-1-5p
• 年，卷（期）: 2022,（5）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 473-481
• 页数: 9页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.cn115791-20211202-00642

摘要

目的:探讨长链非编码RNA 钾电压门控通道亚家族Q成员1重叠转录物1（Kcnq1ot1）通过调节miR-92a-1-5p影响胰岛β细胞胰岛素分泌的作用机制。方法:自2020年6至12月在中山大学附属第三医院招募初诊2型糖尿病（T2DM）患者25例，同时招募年龄匹配且无糖尿病的受试者21例作为对照组。收集受试者的年龄、体重指数（BMI），检测空腹血糖（FPG）和糖化血红蛋白（HbA 1c），采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测血清中Kcnq1ot1表达量，并分析其与FPG和HbA 1c的相关性。12只5周龄雄性C57BL/6J小鼠采用随机数字表法分为高脂饮食（HFD）组（ n=6）和正常饮食（CD）组（ n=6），喂养20周后，提取原代胰岛细胞RNA。将体外培养的Min6细胞分为牛血清白蛋白（BSA）组和棕榈酸（PA，400 μmol/L）组；按照是否转染Kcnq1ot1 siRNA分为si-NC组和si-Kcnq1ot1组；按照是否转染miR-92a-1-5p的模拟物或抑制剂分为：模拟物对照组、模拟物组、抑制剂对照组和抑制剂组；按照转染Kcnq1ot1/NC siRNA后是否加入抑制剂分为si-NC+抑制剂对照组、si-Kcnq1ot1+抑制剂对照组、si-NC+抑制剂组和si-Kcnq1ot1+抑制剂组。采用qRT-PCR检测Kcnq1ot1、miR-92a-1-5p和胰岛素转录本1（ Ins1）、胰岛素转录本2（ Ins2）、胰岛素受体（ Insr）、NK6同源盒蛋白1（ Nkx6.1）、胰岛素受体底物1（ Irs1）和神经生成素3（ Ngn3）mRNA水平；Western blotting检测胰岛素和Insr蛋白表达水平；葡萄糖刺激胰岛素释放实验检测胰岛素分泌水平；双荧光素酶报告基因实验验证Kcnq1ot1与miR-92a-1-5p之间的直接作用关系。各组间指标的差异比较采用独立样本 t检验、方差分析，采用Pearson相关分析法分析受试者Kcnq1ot1表达量与FPG和HbA 1c的相关性。 结果:T2DM患者血清中Kcnq1ot1的表达量较对照组显著下调（ P<0.01），且Kcnq1ot1的表达量与FPG和HbA 1c呈负相关关系（ r=-0.52、-0.49，均 P<0.05）。与CD组相比，HFD组小鼠胰岛中Kcnq1ot1表达量下调（ P<0.001）。在Min6细胞中，与BSA组相比，PA组细胞中Kcnq1ot1表达量下调（ P<0.01）；与si-NC组相比，si-Kcnq1ot1组葡萄糖刺激的胰岛素分泌降低（ P<0.05），且 Ins1、 Ins2、 Insr、 Nkx6.1、 Irs1和 Ngn3的mRNA水平及Insr和胰岛素的蛋白水平均降低（ P<0.05）；与模拟物对照组相比，模拟物组葡萄糖刺激的胰岛素分泌降低（ P<0.05），且 Ins1、 Ins2、 Insr、 Nkx6.1、 Irs1和 Ngn3的mRNA水平及Insr和胰岛素的蛋白水平均降低（ P<0.05）；与抑制剂对照组相比，抑制剂组葡萄糖刺激的胰岛素分泌水平升高（ P<0.05），且 Ins1、 Ins2、 Insr、 Nkx6.1、 Irs1和 Ngn3的mRNA水平及Insr和胰岛素的蛋白水平均升高（ P<0.05）。双荧光素酶报告实验显示，模拟物和Kcnq1ot1-WT质粒共转染细胞后，Kcnq1ot1-WT荧光素酶活性降低（ P<0.05）；抑制剂和Kcnq1ot1-WT质粒共转染细胞后，Kcnq1ot1-WT的荧光素酶活性显著升高（ P<0.05）。与si-NC组相比，si-Kcnq1ot1组miR-92a-1-5p表达升高（ P<0.05）；与si-Kcnq1ot1+抑制剂对照组相比，si-Kcnq1ot1+抑制剂组Min6细胞中的 Ins1、 Ins2、 Insr、 Irs1和 Ngn3转录水平及胰岛素和Insr的蛋白水平升高（ P<0.05）。 结论:长链非编码RNA Kcnq1ot1可能通过靶向调控miR-92a-1-5p影响胰岛β细胞功能。