摘要:

为了研究甘蔗花叶病与甘蔗寄主致病的互作分子机制,利用SMART技术成功构建了感染高梁花叶病毒甘蔗叶片的cDNA文库,用于后续酵母双杂交互作蛋白筛选试验.采用Omega公司Plant RNA Kit提取感染高粱花叶病毒甘蔗叶片总RNA,经过Oligotex纯化获得mRNA,将其反转录成cDNA第一链,再在DNA聚合酶作用下,通过长距离PCR扩增双链cDNA.经SfiI酶切并去除短片段后,连接到pGADT7-SfiI载体上,成功获得初级cDNA文库,最后以初级文库100万克隆为基数扩增,得到扩增文库并提取质粒.经检测构建的文库容量为1.6×106 cfu,文库滴度2.2× 106 cfu/mL,文库cDNA插入片段长度主要分布在700～2 000 bp,文库重组率约为96％.结果表明,该文库质量较好,为筛选分离抗病功能基因及开展寄主与病毒互作的研究奠定了基础.

摘要:

[目的]蜕皮激素在昆虫变态发育中起着关键的调控作用.蜕皮激素活化为20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)后与蜕皮激素受体二聚体[蜕皮激素受体(ecdysone receptor,EcR)和超气门蛋白(ultraspiracle protein,USP)]结合,启动20E诱导的级联反应.本研究旨在从互作蛋白角度探究EcR/USP自身调控的分子机理.[方法]以重要农业害虫斜纹夜蛾Spodoptera litura为研究对象,通过构建酵母双杂交筛选系统分别筛选了与EcR和USP相互作用的蛋白.[结果]文库转化效率达到3.0×106 cfu/μg,文库滴度达到1.3×108 cfu/mL,文库插入片段大小在500～2 000 bp之间.4种诱饵质粒(EcRA/pGBKT7,EcRB1/pGBKT7,USP1/pGBKT7和USP2/pGBKT7)对酵母细胞无毒性,并且无自激活性,说明构建的酵母双杂交文库质量可靠.用以上4种诱饵质粒筛选酵母双杂交文库,共得到110个互作蛋白,其中与EcRB1,USP1和USP2互作的蛋白分别有26,52和32个,未筛选到与EcRA互作的蛋白.随后,从中挑选了DnaJ-5(Hsp40 homolog 5,一种热激蛋白分子伴侣),MBF2(mediator of BmFTZ-F1 type 2,一种转录共激活子),polyubiquitin(多聚泛素类蛋白),esr16(ecdysteroid regulated 16kDa protein,一种蜕皮激素调控蛋白)和NEDD8-1ike(neuralprecursor cell expressed,developmentally down-regulated protein 8,一种泛素调节相关蛋白)5种蛋白,利用酵母双杂交和Far-Western印迹法进一步验证了蛋白间的互作关系.[结论]分子伴侣和泛素化修饰等在蜕皮激素受体调控中可能起着重要作用.本研究对深入理解昆虫变态发育的分子机理具有重要意义.

摘要:

衣藻是用来研究植物光合作用和动物纤毛常用的模式生物.为了研究蛋白质之间的相互作用,利用SMART技术构建了衣藻的酵母双杂交文库.使用Trizol试剂提取鞭毛再生过程和光周期培养的细胞进入分裂前的衣藻细胞的总RNA,经过Oligotex纯化得到mRNA；应用SMART技术和LD-PCR合成双链cDNA,经过CHROMA SPIN TE-400柱子去除短片段的cDNA;cDNA和线性化载体pGADT7-Rec共转化酵母Y187构建酵母双杂交文库.库容达到3.0 × 106CFU,重组率为70％,插入片段平均长度为0.6 kb.以上结果说明该文库质量较好,能够通过筛选文库得到与目的蛋白互相作用的蛋白质,为寻找蛋白质的作用伴侣打下基础.

摘要:

[目的]构建玉米胚芽鞘负向重力生长时期的酵母双杂交文库,并对其进行评价.[方法]以玉米骨干自交系B73为材料,利用Trizol试剂提取玉米胚芽鞘在负向生长时期所表达的总RNA,再利用SMART技术构建酵母双杂交文库,并转化进酵母Y187中.[结果]试验得到的原始文库库容量高达1×106个单克隆；文库中插入的片段集中在0.5～1.5 kb,平均插入长度为800 bp.[结论]试验构建得到了高质量的米胚芽鞘酵母双杂交文库,为研究胚芽鞘的负向重力反应机制奠定了基础.

摘要:

为了高效研究大豆耐非生物胁迫的分子调控网络,运用SMART(Switching Mechanism at 5'End ofthe RNA Transcript)与DSN (Duplex-Specific Nulease)相结合的技术构建了栽培大豆高盐胁迫下根部组织的酵母双杂交cDNA文库.提取高质量的总RNA,利用Oligo (dT)16引物反转录合成cDNA后,经DSN处理,然后利用Advantage 2聚合酶进行长片段PCR扩增,电泳检测显示,产物均一,无高丰度条带,片段范围在0.75～5.00 kb;RT-PCR结果显示,GmActin基因在均一化后表达明显降低,表明均一化效果较好;最后通过SMART同源重组交换技术在酵母菌株Y187中构建了酵母双杂交所需的cDNA文库.文库质量检测结果表明:cDNA文库的总独立克隆数为5.61×106c fu、文库滴度为3.4×1010cfu/mL、重组率大于90％、插入片段长度为0.5～3.0 kb,主要集中在1.0 kb左右.

摘要:

采用SMART技术在酵母菌株AH109中构建了干旱胁迫下水稻根部全长cDNA文库,采用改进的滤膜杂交方法建立了高效酵母杂交体系,以抗旱相关水稻转录调控因子OsWRKy71基因作为诱饵对该方法进行检验.实验获得的酵母杂交文库容量为4.9×10 6,平均插入片段为800 bp,达到了基因分离和克隆等后续研究的标准.同时采用滤膜杂交法将文库的杂交效率提高到了6.9％,是液体杂交法的6倍以上.该方法不需要特殊的设备,且具有低消耗和高效率的特点,可用于高通量酵母双杂交分析.

摘要:

为了建立以本氏烟为模式作物研究SMV侵染机制的平台,以可系统侵染本氏烟的重组型SMV分离物HBRS为毒源,构建感染HB-RS本氏烟的酵母双杂cDNA文库.利用SMART技术获得本氏烟的双链cDNA文库,通过双酶切手段将cDNA文库构建至pGADT7-SfiI载体上.检测结果显示,文库容量约为3.2×106 cfu,插入cDNA片段长度为0.75 ～2.00 kb,平均长度大于1.00 kb,且多态性丰富,表明文库质量较好.该酵母双杂文库的构建为钓取与SMV互作的寄主因子和系统性研究SMV侵染机制奠定了物质基础.

摘要:

为了分离克隆与植物互作的大丽轮枝菌致病相关蛋白基因，利用 SMART 技术构建了大丽轮枝菌酵母双杂交 cDNA 文库。结果表明，构建的文库滴度为5.2×107 cfu/mL，库容为3.9×107 cfu；文库 cDNA 插入片段长度主要分布在0.5~2.0 kb，平均为1 kb；文库重组率为96%。表明文库质量较好，为筛选与植物互作的大丽轮枝菌致病蛋白基因奠定了基础。