摘要:

目的：筛选鉴定针对 HlV -1vpr 基因的小干扰 RNA（siRNA）片段。方法根据 siRNA 设计要求合成siRNA56、siRNA160和 siRNA185寡核苷酸片段，分别转染至含 HIV -1vpr 质粒的 HEK 293T 细胞，并进行总 RNA 提取，采用 Real - time PCR 和 Western blotting 分别从核酸和蛋白水平对 HIV -1vpr 基因表达水平进行验证。结果siRNAs 成功转染含 HIV -1vpr 质粒的 HEK 293T 细胞，降低了 HIV -1vpr 基因的表达水平，其中在 RNA 水平 siRNA160组干扰抑制作用最强，抑制率为89％；在蛋白水平 siRNA56组干扰抑制作用最强，抑制率为96％。结论3个基因片段的 siRNA 均可以下调 HIV -1vpr 的表达水平，但存在差异性，为探索 HIV/ AIDS 基因治疗的可行性和高效性提供了可靠的实验依据。

摘要:

为了建立一套犬IFN-γ(cIFN-γ)在HEK293T细胞中表达的方法,用伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激犬脾细胞,通过RT-PCR方法从脾细胞中扩增犬IFN-γ基因,并将其克隆到pcDNA3.1A载体中,构建的真核表达载体pcDNA3.1A-cIFN-γ经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达.结果表明:克隆的犬IFN-γ cDNA 基因与GenBank上发表的序列一致,同源性100%.表达产物经Western-blot方法检测,证明克隆的犬IFN-γ基因能够在HEK293T细胞中进行表达,并且表达产物能够分泌到细胞外.

摘要:

用Trizol试剂提取猪血白细胞总RNA,根据已发表的序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增出猪β防御素-2(pBD-2)基因,并将该基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成猪β防御素-2基因的真核表达载体pcDNA3.1A/pBD-2,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达.结果表明:本试验扩增的pBD-2基因与已发表的序列完全一致.表达产物经Western-blot检测,证明pBD-2能够在真核细胞HEK293T中表达.

摘要:

为提高重组鸡白细胞介素-7(chIL-7)在真核细胞中的表达水平,本试验分析了影响基因表达的一些因素,包括转染方法、质粒用量、转染时间及表达时间等,对重组chIL-7表达水平的影响,并通过正交试验设计方法确定了利用HEK293T细胞表达重组chIL-7的最适表达条件.结果表明,在T75细胞瓶中,由脂质体介导使用30 μg质粒,转染4h,表达48 h和由磷酸钙介导使用40μg质粒,转染6h,表达60 h可以获得较高的表达效率,表达水平分别为(124±9)和(94.3±8)μg/106个细胞.本结果为进一步研究chIL-7的功能提供有利条件.

摘要:

为探讨绿色荧光蛋白(GFP)在传代细胞中是否能随细胞的增殖稳定表达,构建稳定表达GFP的细胞系统,选取HEK293T细胞,使用第三代慢病毒包装系统,包装表达了GFP的慢病毒,然后用包装好的慢病毒去侵染HEK293T细胞.通过细胞成像技术统计了不同代数细胞的荧光强弱并计算细胞形态大小,利用膜片钳记录了HEK293T细胞的电流-电压(I-V)曲线.实验结果显示,GFP能随细胞的增殖稳定表达,被慢病毒侵染后的细胞的形态及基本电生理活动与正常细胞相比,没有产生显著差异.

摘要:

目的 探讨蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2在三氧化二砷(As2O3)诱导HEK293T细胞凋亡中的作用.方法 将pIRES-GFP空载体、pIRES-GFP-SHP-2野生型和pIRES-GFP-SHP-2C459S突变体载体通过磷酸钙方法 转染HEK293T细胞;在 5 μmol·L-1 的 As2O3孵育 48 h后,用流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot方法 检测Cyt-C、Caspase-3、p-ERK、ERK、p-JNK及 JNK的表达变化.结果 5μmol·L-1 As2O3可诱导HEK293T细胞凋亡,SHP-2能抑制其作用;SHP-2C459S突变体组Cyt-C和Caspase-3表达均高于空载体组,SHP-2野生型组则低于空载体组;SHP-2野生型组p-ERK表达高于空载体组,SHP-2C459S突变体组则相反;p-JNK的表达,SHP-2C459S突变体组高于空载体组,而SHP-2野生型组低于空载体组.结论 SHP-2可抑制As2O3诱导的HEK293T细胞凋亡,其机制可能与激活ERK和抑制JNK途径有关.

摘要:

目的 建立一个有效表达CD23的系统.方法 采用RT-PCR方法,从外周血淋巴细胞中扩增人的CD23 cDNA基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1B上,构建成pcDNA3.1/CD23 质粒表达载体;将pcDNA3.1/CD23质粒转染HEK293T细胞,通过流式细胞仪和Western blot检测CD23在细胞中的表达情况.结果 扩增的CD23 cDNA序列与文献报道的一致;通过构建表达载体和转染细胞实现了CD23 cDNA在293T细胞膜上的表达.转染效率达80%以上,并获得了较高水平的表达.结论 扩增CD23 cDNA基因,经过转染HEK293T细胞,实现了CD23在HEK293T细胞的高效表达.

摘要:

目的 建立一个有效表达FGFR1的真核系统.方法 从人胎盘组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增得到FGFR1基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1上,构建成pcDNA3.1-FGFR1质粒表达载体,并在HEK293T细胞重组表达;将pcDNA3.1-FGFR1质粒转染HEK293T细胞,通过免疫印迹和免疫荧光检测FGFR1在细胞中的表达情况.结果 扩增的FGFR1序列与数据库一致;通过构建表达载体和转染细胞实现了FGFR1 cDNA在HEK293T细胞膜上的表达.结论 成功扩增出FGFR1 cDNA基因,经过转染HEK293T细胞,实现了FGFR1在HEK293T细胞的高效表达.

摘要:

目的 利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因常见突变位点——c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T细胞,为后期研究其基因修复提供可靠的细胞模型.方法 针对G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点靶向设计4对向导RNA(sgRNA),构建表达Cas9-sgRNA的外源PX458质粒,将其转染至HEK293T细胞内,通过流式细胞术分选表达GFP荧光蛋白的细胞进行培养,利用T7核酸内切酶1(T7E1)酶切验证CRISPR/Cas9的剪切效率,有限稀释法筛选单克隆细胞,测序鉴定并检测G6PD mRNA、蛋白表达和细胞功能的改变.结果 成功构建基于G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的Cas9-sgRNA外源PX458质粒,T7E1酶切检测四对sgRNA的编辑效率分别为6.74％、12.36％、12.54％、2.94％.测序鉴定敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的细胞株构建成功,细胞G6PDmRNA、蛋白表达和G6PD酶活性降低,细胞增殖能力下降,维生素K3诱导细胞死亡增加.结论 本研究成功构建敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞模型,为后期研究基因的修复奠定了基础.

摘要:

旨在利用类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)技术构建具有活性的敲除类激活素激酶受体4(Activin receptor-like kinase 4,ALK4)的TALEN质粒.利用TALEN在线设计工具,根据TALEN设计原则和ALK4剪接异构体的共同序列确定基因敲除的靶位点、TALEN识别序列和用于活性验证的限制性酶切位点.利用质粒文库试剂盒快速构建TALEN质粒,并通过酶切、测序和BLAST比对加以验证.应用脂质体转染法将构建质粒导入HEK293T细胞,通过共转染的pEGFP-N1质粒判断转染效率.利用嘌呤霉素进行阳性筛选后提取基因组DNA,PCR扩增靶序列,HhaⅠ酶切纯化后的PCR产物.结果显示,来自转染TALEN质粒细胞基因组的PCR产物的酶切效率明显下降,提示部分细胞的ALK4基因发生了突变.首次成功构建了在HEK293T细胞中有活性的TALEN质粒.