假单胞菌海因酶基因在大肠杆菌中的高效表达

• 作者: 刘景晶 李志强 胡卓逸
• 来源期刊: 中国生物化学与分子生物学报
• 学科: 生物学
• 关键词: D-对羟基苯甘氨酸 海因酶 恶臭假单胞菌 基因表达
• 年，卷（期）: 2002,（2）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 145-150
• 页数: 6页
• 分类号: Q786
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1007-7626.2002.02.007

摘要

为实现利用生物酶转化法进行D-对羟基苯甘氨酸的工业化生产,构建了3株海因酶基因工程菌.利用PCR技术从恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CPU 9801染色体DNA中扩增得到长约1.8kb的含编码区和自身启动子的海因酶全基因.通过将海因酶全基因插入pMD18-T质粒、海因酶基因的编码区与pET 17-b质粒重组、海因酶基因编码区和T7强启动子一起插入pMD18-T质粒分别得到重组质粒pMD-dht、pET-dht和pMD-T7-dht.将上述重组质粒分别转化大肠杆菌(Escherichiacoli),通过地高辛标记菌落原位杂交和海因酶活力测定两种方法,筛选出具有海因酶活力的阳性转化子.结果表明,大肠杆菌的RNA聚合酶能够识别和结合来自恶臭假单胞菌海因酶基因的自身启动子,该启动子在大肠杆菌中能够工作.基因工程菌E.coli BL21/pMD-dht、E.coli BL21/pET-dht和E.coli BL21/pMD-T7-dht的海因酶活力分别为1 700U/L、1 900U/L和2 500U/L,比野生菌P.putida CPU 9801的海因酶活力分别提高了8倍、9倍和12倍.薄层扫描结果显示,这些工程菌的海因酶表达量分别约占菌体总可溶性蛋白质的20%、31%和57%.SDS-PAGE显示,海因酶的单体分子量约为50 kD.经工程菌E.coli BL21/pMD-T7-dht催化,底物对羟基苯海因的转化率在13 h内可达到96%.所构建的海因酶基因工程菌不需IPTG诱导即可实现高表达,已初步具有工业化应用前景.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	刘景晶	中国药科大学生物化学研究室	116	553	12.0	18.0
2	胡卓逸	中国药科大学生物化学研究室	19	264	8.0	16.0
3	李志强	中国药科大学生物化学研究室	5	43	5.0	5.0