聚合酶链反应诱导丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶活性位点的突变及突变HCVNS3/4a蛋白的表达

• 作者: 封波 陈勇 魏来
• 来源期刊: 中华微生物学和免疫学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 丙型肝炎病毒 丝氨酸蛋白酶 聚合酶链反应 诱导突变
• 年，卷（期）: 2002,（1）
• 所属期刊栏目: 病毒学
• 页码范围: 16-19
• 页数: 4页
• 分类号: R37
• 字数: 2982字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/j:issn:0254-5101.2002.01.007

摘要

目的以聚合酶链反应(PCR)突变方法诱导丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶活性位点ser1165的突变,获得全长非结构基因3(NS3)/4a的表达与纯化. 方法分别以NS3 N端正向引物与诱变反向引物,诱变正向引物与NS4a C端反向引物获得2个PCR产物,产物纯化后在新的PCR反应体系中加入以上2个PCR产物与NS3 N端正向引物、NS4a C端反向引物.再次PCR扩增突变模板,分别与野生型模板重组入表达载体pET26-Ub,转化大肠杆菌BL21(DE3)pCG1,诱导表达后经菌体裂解、纯清化、硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose、NTA纯化,Western blot分析表达蛋白的特异性及PCR诱导突变使HCV蛋白酶活性位点失活的作用. 结果获得诱导突变的模板,Western blot证实该突变可完全阻断对NS3丝氨酸蛋白酶与NS3螺旋酶间的切割,部分阻断了螺旋酶与NS4a间的切割.纯化后的HCV NS3/4a蛋白在SDS-PAGE胶上显示为双带. 结论 PCR突变方法简便、有效,获得丝氨酸蛋白酶失活的NS3蛋白表达,NS3蛋白与NS4a蛋白以复合物形式存在.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	魏来	徐州医学院附属医院传染病科	14	26	3.0	4.0
2	封波	徐州医学院附属医院传染病科	10	19	3.0	4.0
3	陈勇	徐州医学院附属医院传染病科	10	35	4.0	5.0