人凝血酶敏感蛋白1抗血管生成活性片段重组腺病毒高效制备

• 作者: 刘澎 杨仁池 王一 蔡英林 韩忠朝 顾洁
• 来源期刊: 中国医学科学院学报
• 关键词: 凝血酶敏感蛋白1 AdEasy System 基因治疗 腺病毒
• 年，卷（期）: 2003,（3）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 312-315
• 页数: 4页
• 分类号: R322.1+2|R730.23
• 语种: 中文

摘要

目的构建人凝血酶敏感蛋白1(thrombospondin1,TSP1)抗血管生成片段重组腺病毒.方法采用RT-PCR方法从正常人外周血单个核细胞扩增编码TSP1抗血管生成活性片段(TSP1f)的cDNA序列,并将其克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV上,以线性化重组穿梭载体与超螺旋腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,进行同源重组并酶切鉴定筛选正确重组子,用线性化重组质粒转染人胚肾293细胞,制备重组腺病毒ADV-TSP1 f,最后以PCR及Western blot方法鉴定TSP1抗血管生成片段的表达.结果细菌内同源重组共获得43个卡那霉素抗性克隆,经酶切鉴定表明其中直径最小的10个均为正确重组子,该重组质粒转染293细胞所获得的重组腺病毒可高效表达TSP1抗血管生成片段,纯化后病毒滴度为1.0×1011 pfu/mL.结论细菌内同源重组法构建重组腺病毒高效快捷,所获得的ADV-TSP1f可进一步应用于抗肿瘤血管生成的基因治疗研究.