人GPR81-Gi1α融合蛋白在杆状病毒系统中的表达及优化

• 作者: 刘永学 吴芳明 彭明丽 朱欣凯 王琼 韩春光 黄琳仪
• 来源期刊: 生物技术通报
• 学科: 医学
• 关键词: GPR81 Gi1α融合蛋白 bac-to-bac杆状病毒表达
• 年，卷（期）: 2008,（z1）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 149-154
• 页数: 6页
• 分类号: R3
• 字数: 4806字
• 语种: 中文

摘要

旨在建立获得融合蛋白GPR81-Gi1α的方法和最优条件.采用RT-PCR从人胚胎肾及大脑组织总RNA中分别扩增孤儿G蛋白偶联受体GPR81和Gi1α的完整表达序列(分别为1 041bp和1 065bp),并构建各自的重组质粒pcDNA3.1(+)-GPR81及pcDNA3.1(+)-Gila,再以重组质粒为模板,运用重叠延伸PCR法扩增得到融合基因GPR81-Gi1a,测序无误后将融合基因与pFASTBacl重组得重组质粒pFASTBacl-GPR81-Gi1α.而后转化DH10Bac,使该融合基因重组质粒发生特异性的转座和病毒重组,获得杆状病毒表达穿梭质粒pBacmid-GPR81-Gi1α,再将该重组杆粒转染昆虫sf9细胞,获得含杆状病毒的细胞分泌上清,以上清在不同条件下(包括不同感染时间、滴度等)感染sf9细胞以优化融合蛋白在昆虫sf9细胞的表达条件.结果表明,感染72h且感染强度moi为5时是融合蛋白在sf9细胞中高效表达的理想条件.该表达体系的建立及蛋白表达条件的优化,保证了足量GPR81-Gi1α融合蛋白的制备.