通过引物设计和提高退火温度提高实时定量PCR检测microRNA的特异性

• 作者: 何湘君 刘玉京 张旗 潘秀英
• 来源期刊: 北京大学学报医学版
• 关键词: 微RNAs 逆转录聚合酶链反应 DNA引物 基因表达谱
• 年，卷（期）: 2009,（6）
• 所属期刊栏目: 技术方法
• 页码范围: 691-698
• 页数: 8页
• 分类号: R34
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1671-167X.2009.06.016

摘要

目的:了解因某些microRNA(miRNA)家族成员序列相似,以及同一种成熟miRNA的长度不均一对PCR定量检测结果的影响,寻找区分相似miRNA成员和准确定量的方法和条件.方法:采用RNA加尾和引物延伸实时定量RT-PCR法,设计不同位置错配的引物,以克隆到质粒中的全长成熟miRNA为模板,比较在不同退火温度下各种错配引物与完全匹配引物在扩增miRNA上的效率差异,并根据由此得出的经验设计let-7家族成员引物,以克隆的成熟miRNA为模板,检测其在不同退火温度下区分相似家族成员的能力.此外,设计了10组3'末端碱基位置不同的特异引物,比较了它们在检测小鼠大脑miRNA表达水平上的差异.结果:提高退火温度12℃～14℃将最大限度增加特异性而不降低敏感性,将引物的3'末端置于差异碱基或其附近可以有效区分相似miRNA序列,将引物3'末端置于miRNA第18～20个碱基,可避免漏检较短的成熟miRNA,使定量更真实准确.结论:精心设计引物并提高退火温度可提高实时定量PCR检测microRNA的特异性和准确性.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	潘秀英	北京大学人民医院临床分子生物学研究所中心实验室	10	104	5.0	10.0
2	何湘君	北京大学人民医院临床分子生物学研究所中心实验室	27	242	10.0	14.0
3	张旗	北京大学人民医院临床分子生物学研究所中心实验室	21	188	8.0	13.0
4	刘玉京	北京大学人民医院临床分子生物学研究所中心实验室	10	75	6.0	8.0