人RORγt mRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

• 作者: 仝佳 史烨 崔大伟 杨先知 柳迎昭 王海生 王胜军 田洁 许化溪 陈建国
• 来源期刊: 江苏大学学报（医学版）
• 学科: 医学
• 关键词: RORγt 实时定量PCR SYBR Green Ⅰ
• 年，卷（期）: 2009,（5）
• 所属期刊栏目: 检验医学
• 页码范围: 405-408
• 页数: 4页
• 分类号: R446.6
• 字数: 2993字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1671-7783.2009.05.010

摘要

目的: 建立检测人RORγt(retinoid-related orphan receptor gammat) mRNA的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR, qRT-PCR)方法.方法: 根据人RORγt mRNA的保守序列设计特异性引物,提取经PMA和离子霉素刺激的人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)总RNA,并逆转录成cDNA,与pMD-18T载体连接构建质粒标准品.采用qRT-PCR方法检测RORγt mRNA水平,并评价该方法的线性、特异性及重复性.应用该方法检测Graves病(Graves′ disease, GD)患者外周血中RORγt mRNA的相对表达.结果:该方法标准曲线的相关系数为0.998,融解曲线分析显示单个峰,pMD18T-RORγt质粒标准品高、低拷贝数的批内、批间变异系数分别为6.5%,8.4%和9.6%,11.2%.初步研究表明GD患者组RORγt mRNA的相对表达水平明显高于健康对照组(t=-3.72, P<0.01).结论: 建立的检测人RORγt mRNA的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法灵敏、特异且重复性好,为临床应用提供了实验基础.