改良通用茎环引物筛查和定量检测微小RNA方法的建立

• 作者: 夏鹏 杨云秀 杨亦荣 王斯璐 白永恒 蔡勇 郑少玲 陈必成
• 来源期刊: 中华检验医学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 微小RNAs T淋巴细胞 聚合酶链反应 筛选
• 年，卷（期）: 2011,（10）
• 所属期刊栏目: 分子诊断
• 页码范围: 926-930
• 分类号: R1
• 字数: 4879字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2011.10.013

摘要

目的 建立可同时筛选和定量检测成熟型miR的荧光定量PCR方法.方法 改良通用茎环引物,在其茎环尾端引入8个随机碱基片段,用于成熟型miR逆转录,以建立SYBR Green PCR筛选和定量检测miR的方法(简称“改良通用茎环引物miR法”).同时,采用10倍梯度稀释的miR-155标准品cDNA(1～109拷贝/μl)评价其灵敏度；采用熔解曲线评价其检测miR-155的特异性；通过对2×105、2×106、2×107拷贝/μl的miR-155标准品cDNA分别进行批内20次重复实验,以其循环阈值(Ct)的变异系数(CV)评价其精密度；并与传统茎环法进行比较,计算实验所用时间和引物成本.然后,采用改良通用茎环引物miR法对植物血凝素(PHA)刺激培养0、16、24、48、72 h的人外周血T淋巴细胞内miR进行筛选(87个靶miR,经PubMed检索可能与免疫功能相关),并用以进行miR定量检测分析.结果 建立的改良通用茎环引物法的最低检测限为103拷贝/μl的miR-155 cDNA标准品；熔解曲线于80℃呈单峰,证实为针对miR-155的特异性扩增；其批内重复实验的精密度为CV＜2.5％.优化后的通用引物方法与传统方法相比较,节约引物约75％(1 917 bp比7 851 bp),节省逆转录时间约120min(85 min比205 min).用改良通用茎环引物法筛选T淋巴细胞中87个miR,85个miR在PHA刺激前、后的Ct无变化,而miR-150和miR-155表达量在T淋巴细胞激活前后分别发生超过10倍下降(72 h)和8倍的升高(48 h),且差异有统计学意义(Z=-2.023,P=0.043;Z=-2.032,P=0.042).结论 建立的改良通用茎环引物miR法具有快速、重复性好、灵敏、节约引物用量和实验时间的优点,可用于T淋巴细胞的miR筛查和定量检测.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	杨亦荣	温州医学院附属第一医院移植中心	85	341	9.0	15.0
2	夏鹏	温州医学院附属第一医院移植中心	46	102	5.0	7.0
3	郑少玲	温州医学院附属第一医院移植中心	64	222	8.0	11.0
4	蔡勇	温州医学院附属第一医院移植中心	28	65	5.0	6.0