多靶向VEGF-EGFR的Fc融合蛋白EVP1的构建及其结合特性

• 作者: 叶真龙 左明辉 易中梅 金华君 钱其军 黎江
• 来源期刊: 中国肿瘤生物治疗杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 肿瘤 靶向治疗 融合蛋白 血管内皮生长因子 表皮生长因子受体 Fc段 亲和力
• 年，卷（期）: 2012,（3）
• 所属期刊栏目: 研究快报
• 页码范围: 239-246
• 分类号: R735.7|R730.51
• 语种: 中文
• DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2012.03.002

摘要

目的:构建能同时靶向表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)的Fc融合蛋白EVP1,并分析其多靶向结合功能,为后续的抗肿瘤研究奠定基础.方法:利用PCR方法扩增Herin基因和Fh-1基因Ig样第二结构域( Flt-1 D2)编码序列,全序列合成带有点突变的人IgG1的Fc段编码序列.利用重组PCR方法将Herin、Fh-ID2和Fc基因依次连接,构成Herin-Fh- 1D2- Fc基因(命名为EVP1基因).再将EVP1编码基因插入质粒pDC659,构建携带EVP1基因的腺病毒穿梭质粒pDC659-EVP1.将质粒pDC659-EVP1与腺病毒骨架载体pPE3-F35共转染至293细胞,包装获得表达EVP1融合蛋白的非增殖型腺病毒Ad5/35-EVP1,经PCR鉴定,扩增、纯化病毒,采用50％组织培养感染剂量(TCID50)法测定病毒滴度.用MOI=11的腺病毒Ad5/35-EVP1感染293细胞,4d后收集细胞培养上清液.采用硫酸铵盐析法和ProteinG亲和层析对融合蛋白EVP1进行纯化.Western blotting检测细胞培养上清液中融合蛋白EVP1的表达,ELISA法检测细胞培养上清液中融合蛋白EVP1的含量.采用间接免疫荧光实验和Octet Red 96生物分子相互作用分析仪对融合蛋白EVP1的靶向结合特性进行定性和定量检测.结果:成功包装出腺病毒Ad5/35-EVP1,滴度为5.4×109 PFU/ml.腺病毒Ad5/35-EVP1-293细胞系统能有效表达融合蛋白EVP1;MOI=11时、融合蛋白EVP1的表达量为(1 613.94 ±24.65) ng/ml.蛋白EVP1与高表达EGFR的A431细胞和高表达HER2的人卵巢癌SK-OV-3细胞有良好的结合能力,与抗原EGFR、HER2、VEGF结合的亲和力常数Kd分别为4.55、18.70和0.63 nmol/L.结论:成功制备多靶向融合蛋白EVP1,它能高效结合VEGF、ECFR受体家族成员,具有良好的抗肿瘤临床应用价值.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	叶真龙	浙江理工大学新元医学与生物技术研究所	3	5	1.0	2.0
2	左明辉	浙江理工大学新元医学与生物技术研究所	1	4	1.0	1.0