携带siSPK1重组腺病毒的构建及其对N2a细胞凋亡的影响

• 作者: 吕冰洁 孙圣刚 张远 杨阳 汪敏 马嵘 黎钢
• 来源期刊: 中国细胞生物学学报
• 关键词: SPK1基因 RNA干扰 腺病毒载体
• 年，卷（期）: 2012,（8）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 775-780
• 页数: 6页
• 语种: 中文

摘要

应用AdMax腺病毒载体系统构建携带siSPK1基因的重组腺病毒,进一步研究SPK1基因对N2a细胞凋亡的影响.设计可形成小发夹结构的SPK1-siRNA模板cDNA序列,克隆至质粒pDC316-siRNA,构建SPK1- siRNA穿梭质粒pDC316-SPK1,经鉴定正确后,将pDC316-SPK1与辅助包装质粒(pBHG lox △E1,3 Cre)共转染至HEK293细胞,包装纯化并扩增重组腺病毒颗粒,终点稀释法测定病毒滴度；病毒感染N2a细胞,Western blot法检测SPK1蛋白的表达；Hoechst33258染色检测SPK1基因对N2a细胞凋亡的影响.酶切后PCR分析、测序鉴定表明,pDC316-SPK1构建成功,病毒纯化后滴度为2.50E+10 PFU/mL;重组病毒可在蛋白水平抑制SPK1的表达；SPK1基因抑制后,N2a细胞凋亡增加(P＜0.001).上述结果表明,含有SPK1-siRNA的重组腺病毒构建成功,且具有抑制SPK1蛋白表达的功能,该基因沉默后,N2a细胞凋亡增加.