稳定沉默GRP78基因的胰腺腺泡细胞株AR42J的建立

• 作者: 刘勇 周总光 周斌 晏会 李园 杨烈 陈珂玲
• 来源期刊: 四川大学学报（医学版）
• 学科: 医学
• 关键词: 葡萄糖调节蛋白78 RNA干扰 慢病毒 急性胰腺炎 AR42J
• 年，卷（期）: 2012,（5）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 645-650
• 分类号: R1
• 语种: 中文

摘要

目的 设计并构建编码大鼠葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的短发夹样RNA (shRNA)慢病毒载体,用以建立稳定沉默GRP78基因的大鼠胰腺腺泡细胞株AR42J.方法 设计并合成3条编码大鼠GRP78 mRNA的shRNA质粒表达载体,用三质粒包装系统包装成慢病毒,并以相应慢病毒转导大鼠胰腺腺泡细胞株AR42J.经流式细胞分选术(FCAS)筛选出绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞,采用real-time PCR及Western blot方法检测GRP78基因的mRNA和蛋白表达.结果 测序证实,成功构建了编码GRP78的shRNA慢病毒载体LVshGRP78-1、LVshGRP78-2和LVshGRP78-3.慢病毒转导AR42J细胞后,经荧光显微镜和FCAS证实转导效率＞85％.经real-time PCR验证,与未处理组相比,LVshGRP78-1、LVshGRP78-2和LVshGRP78-3处理组对GRP78 mRNA表达的沉默效率分别为69.4％±1.42％、74.7％±1.69％和86.6％±1.73％ (P＜0.05),含无义序列的阴性质粒LV-Non Target对照组与未处理组相比,GRP78 mRNA的表达差异无统计学意义(P＞0.05).Western blot结果显示各组GRP78蛋白表达与mRNA表达趋势一致.结论 成功构建了编码GRP78的shRNA慢病毒载体,建立了稳定沉默GRP78基因的胰腺腺泡细胞株AR42J,为探讨GRP78基因在急性胰腺炎发病机制中的作用提供了新的细胞模型.