山羊Klf4基因克隆、原核表达和His-Klf4融合蛋白纯化

• 作者: 卢克焕 卢晟盛 叶新慧 张明 李恭贺 王丽霞 申魁魁 符欣蕙 辛桂瑜 郑喜邦
• 来源期刊: 生物技术通报
• 关键词: Klf4 分子克隆 原核表达 蛋白纯化 山羊
• 年，卷（期）: 2013,（2）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 80-85
• 语种: 中文

摘要

旨在克隆山羊Klf4基因,构建重组质粒pET30a-Klf4,通过原核表达技术获得纯化的His-Klf4融合蛋白.从山羊的生殖脊中提取总RNA,用RT-PCR的方法扩增Klf4基因编码区序列,通过TA克隆构建pMD18-T-Klf4重组质粒.酶切鉴定与测序分析后将Klf4的cDNA亚克隆至pET-30a载体,构建重组质粒pET30a-Klf4.酶切鉴定后将其导入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测确认,镍离子金属螯合亲和层析法纯化His-Klf4融合蛋白.结果表明:(1)从山羊生殖脊中克隆了Klf4基因,其开放阅读框由1 434个核苷酸组成,编码478个氨基酸,而且该序列与绵羊的同源性最高,达到98.5％；(2)经过SignalP 4.0在线分析,Klf4的编码蛋白不存在信号肽；(3)经SDS-PAGE和Western blotting分析表明,重组质粒pET30a-Klf4在大肠杆菌中得以表达；在变性条件下纯化,获得了His-Klf4融合蛋白.