鼠源eIF4A1基因克隆及其原核/真核表达鉴定

• 作者: 李梦茹 张文 段辰星 马良 栗朵朵 彭璟 梁晶晶 罗廷荣 李晓宁
• 来源期刊: 南方农业学报
• 关键词: 鼠源 真核生物翻译起始因子(eIFs) eIF4A1基因 原核表达 真核表达 生物信息学分析
• 年，卷（期）: 2023,（10）
• 所属期刊栏目: 畜牧·兽医·水产·蚕桑
• 页码范围: 258-267
• 页数: 10页
• 语种: 中文

摘要

【目的】克隆昆明小鼠真核生物翻译起始因子4A1基因（eIF4A1）并构建其原核/真核表达载体，探究其结构和生物学特性，为在体内外鉴定e IF4A1互作蛋白网络打下基础。【方法】以昆明小鼠脑组织总RNA反转录合成的cDNA为模板，PCR扩增鼠源e IF4A1基因编码区（CDS）序列，然后克隆到pGEX-4T-1和pcDNA3.0载体上分别构建原核/真核表达载体；利用大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞对原核表达载体进行诱导表达、纯化及鉴定；同时以真核表达载体转染HEK-293T细胞，通过Western blotting和间接免疫荧光（IFA）检测eIF4A1蛋白在HEK-293T细胞内的表达及分布情况；并以ProtParam、ProtScale、TMHMM-2.0、SignalP-5.0、SOPMA和SWISS-MODEL等在线软件对鼠源eIF4A1蛋白进行生物学信息分析。【结果】鼠源eIF4A1基因CDS序列长1221 bp，克隆到pGEX-4T-1载体能成功构建原核表达载体pGEX-4T-eIF4A1-Flag，在25和30℃下经0.5 mmol/L IPTG诱导均能大量表达出融合蛋白eIF4A1-Flag，且主要以包涵体形式存在。将鼠源eIF4A1基因克隆至pcDNA3.0载体成功构建获得真核表达载体pcDNA3.0-eIF4A1-Flag，以其转染HEK-293T细胞后，eIF4A1蛋白在HEK-293T细胞中成功表达，且主要分布在细胞质中。生物信息学分析结果表明，eIF4A1蛋白相对分子量为46.15408 kD，理论等电点（pI）为5.267，含有407个氨基酸残基；属于不稳定的亲水性非分泌蛋白，无跨膜结构，也没有信号肽，其二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。鼠源eIF4A1蛋白的主要互作蛋白有10个，除eIFs家族蛋白外，还包括Paip1和Pdcd4互作蛋白。【结论】eIF4A1主要是分布在细胞质，为不稳定的亲水性非分泌蛋白，无跨膜结构和信号肽，通过构建原核/真核表达载体表达获得的融合蛋白eIF4A1-Flag可用于筛选和鉴定eIF4A1互作蛋白，为深入探究eIFs的结构及生物学功能提供技术支持。