猪胰岛素启动子调控 EGFP 表达载体的优化及体外验证

• 作者: 于淑珍 冯冲 宋小凤 潘登科 石宁宁
• 来源期刊: 中国实验动物学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 胰岛素启动子PIP 特异性表达 小鼠胰岛素瘤β细胞株MIN-6细胞 EGFP 五指山小型猪
• 年，卷（期）: 2014,（6）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 34-39
• 页数: 6页
• 分类号: Q95-33
• 字数: 4344字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1005-4847.2014.06.006

摘要

目的：获得猪胰岛素启动子调控外源基因的高效表达载体，为制备转基因猪胰岛特异性表达目的基因奠定基础。方法利用猪胰岛素启动子（ PIP，包含5′调控区、第一外显子、第一内含子及第二外显子ATG前的序列共1．5 kb）构建表达载体，连接PIP和EGFP的酶切位点HindⅢ设计在起始密码子前，命名为PIP－HindIII－EGFP。鉴于酶切位点的插入位置可能会影响外源基因的表达效率，对载体进行了优化：将HindIII酶切位点删除，实现PIP和EGFP无缝连接，载体命名PIP－EGFP；将第一内含子3′端的内含子剪接受体位点（ splicing acceptor site， SA）突变为HindIII内切酶识别位点，命名为PIP－SA（ M）－EGFP。三种载体分别电转染小鼠胰岛素瘤β细胞株MIN－6细胞、猪耳成纤维细胞以及猪肾细胞，48 h后通过荧光强度、流式分析、RT－PCR及Western blot检测，验证载体的表达效率。结果转染细胞后，三种载体都仅在MIN－6胰岛β细胞表达绿色荧光。 RT－PCR及其产物测序结果显示三种载体的胰岛素启动子第一内含子的剪切存在差异：载体PIP－HindIII－EGFP和PIP－EGFP的内含子存在剪切和不剪切两种情况，剪切不稳定；载体PIP－SA（ M）－EGFP的SA位点突变后内含子不剪切，流式细胞及Western blot检测显示，与另外两种载体相比，该载体目的蛋白的表达量最高。结论通过突变胰岛素启动子第一内含子的3′端的剪接受体位点，成功获得了胰岛β细胞的高效表达载体，可用于制备胰岛特异表达外源基因的转基因猪。

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	冯冲	中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业部畜禽遗传资源与种质创新重点实验室	8	16	3.0	3.0
2	石宁宁	中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业部畜禽遗传资源与种质创新重点实验室	2	3	1.0	1.0
3	于淑珍	中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业部畜禽遗传资源与种质创新重点实验室	2	1	1.0	1.0
7	宋小凤	中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业部畜禽遗传资源与种质创新重点实验室	1	1	1.0	1.0