通用型基因打靶载体的构建及其功能鉴定

• 作者: 刘晓蕾 刘烨 刘莹莹 王小海 王毅 郭泽坤
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 关键词: 同源重组 通用型打靶载体 Cre-LoxP 转基因动物
• 年，卷（期）: 2014,（4）
• 所属期刊栏目: 研究资源与技术改进
• 页码范围: 508-519
• 页数: 12页
• 字数: 8274字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2014.04.015

摘要

利用DNA同源重组(基因打靶)技术对动物基因组进行遗传修饰是转基因研究的重要手段之一.本研究以pEGFP-C1载体为载体骨架,成功构建了包含两个多克隆位点、两个同向LoxP(locus of crossing-over(x) in Pl)序列和正负筛选标记基因的通用型打靶载体pGT-C1.正筛选标记新霉素磷酸转移酶基因(Neo)和水母绿色荧光蛋白基因(AcGFP)在两个LoxP序列之间;负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV-tk和两个多克隆位点序列分别在两个LoxP序列外侧.经双酶切和测序证明载体构建成功后,转染胎牛成纤维(fetal bovine fibroblast,FBF)细胞,利用遗传霉素(G418)和丙氧鸟苷(GANC)分别对正负筛选标记进行功能验证;随后将Cre重组酶表达载体转染阳性FBF细胞,用半定量PCR检测Cre-LoxP系统的切割效率;最后构建针对牛(Bos taurus)β酪蛋白质基因的打靶载体pGT-L-R,并在转染药筛后对其打靶功能进行检测.打靶载体pGT-C1具有以下优点:包含两个多克隆位点,方便长短同源臂的定向插入,极大提高了该载体的通用性;位于两个同向LoxP之间的绿色荧光标记基因AcGFP可实时监控载体的转染效率和整合效率,还能依据荧光表达筛选去除筛选标记的阳性细胞,降低筛选标记在中靶细胞中可能产生的负面影响,为高效基因打靶提供了保证.综上所述,本研究成功构建了更加实用、有效的通用型打靶载体pGT-C1,以及针对牛β酪蛋白质基因的打靶载体pGT-L-R,并成功获得了转基因牛成纤维细胞单克隆,为转基因动物模型的建立提供了基础工具.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	刘晓蕾	西北农林科技大学生命科学学院	4	35	2.0	4.0
2	王小海	西北农林科技大学生命科学学院	3	9	1.0	3.0
3	郭泽坤	西北农林科技大学生命科学学院	15	12	2.0	3.0
4	王毅	西北农林科技大学生命科学学院	17	14	3.0	3.0
5	刘烨	西北农林科技大学生命科学学院	6	21	3.0	4.0
6	刘莹莹	西北农林科技大学生命科学学院	2	6	1.0	2.0