森林革蜱半饱血雄蜱抑制消减杂交cDNA文库的构建及差异基因的分析

• 作者: 刘新欣 刘琪 孟庆峰 崔洁 徐展 王伟利 王伟琳
• 来源期刊: 中国寄生虫学与寄生虫病杂志
• 关键词: 森林革蜱 抑制消减杂交 cDNA文库 差异基因
• 年，卷（期）: 2014,（4）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 274-279
• 语种: 中文

摘要

目的 构建森林革蜱(Dermacentor silvarum)半饱血雄蜱抑制消减杂交cDNA文库,分析差异基因.方法 以森林革蜱半饱血雄蜱为实验组(tester),未吸血雄蜱为对照组(driver),分别提取总RNA,SMARTER PCR合成双链cDNA,RsaⅠ酶切后连接接头并进行抑制消减杂交.巢式PCR扩增杂交产物,经柱纯化后连接至PMD-18T中,转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,进行蓝白斑筛选,并计算文库滴度和重组率.随机挑选阳性克隆,反向Northern 杂交(Northern blotting)和RT-PCR法检测抑制消减杂交cDNA文库的消减效率.随机选取差异基因阳性克隆送测序,利用Blastn和Blastx对测序结果进行核酸种类同源性分析和蛋白种类同源性的比对和功能预测.结果 电泳结果显示,森林革蜱半饱血雄蜱和未吸血雄蜱的ds cDNA均呈弥散拖影,大小在500 bp以上,经RsaⅠ酶切后,大小在100～1000 bp;接头连接效率大于25％.巢式PCR结果显示,消减的ds cDNA呈聚集条带,大小在250～500 bp.构建的森林革蜱半饱血雄蜱抑制消减杂交cDNA文库的滴度为700 000 pfu/ml,重组率为88.5％ (239/270).反向Northern blotting检测结果显示,当以森林革蜱半饱血雄蜱单链cDNA为探针时,消减文库信号较强;以未吸血雄蜱单链cDNA为探针时,消减文库信号较弱.RT-PCR结果显示,随机选取的8个阳性克隆中,有5个在半饱血状态下表达上扬,抑制消减杂交cDNA文库消减效果较好.115个阳性克隆测序得到87个差异表达序列标签(ESTs),大小为200～800 bp.Blastn分析结果显示,87个序列中,与其他蜱基因有同源性的53个,同源性为70％～98％,与库蚊、甲虫和果蝇等其他昆虫基因有同源性的34个,同源性为32％～65％.Blastx预测结果显示,序列中片段表达的蛋白包括参与吸血和血液消化的不同酶类,主要功能为能量代谢、信号传导和转录调节等. 结论 建立了森林革蜱半饱血雄蜱抑制消减杂交cDNA文库,差异基因的功能预测与蜱的吸血和血液消化等有关.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	王伟利		70	397	10.0	16.0
2	孟庆峰		43	273	10.0	14.0
3	刘新欣	吉林农业大学动物科学技术学院	3	8	2.0	2.0
4	王伟琳		2	2	1.0	1.0
5	刘琪	吉林农业大学动物科学技术学院	6	32	3.0	5.0
6	徐展	吉林农业大学动物科学技术学院	2	3	1.0	1.0
7	崔洁	吉林农业大学动物科学技术学院	3	7	2.0	2.0