CYP3A4沉默细胞株建立及其对三氯乙烯毒性的影响

• 作者: 吴德生 徐新云 毛侃琅 毛吉炎 秦逍云 袁建辉 谢杏 谭琴 黄海燕
• 来源期刊: 毒理学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 肝细胞 CYP3A4 慢病毒载体 CYP3A4基因沉默细胞 三氯乙烯
• 年，卷（期）: 2014,（1）
• 所属期刊栏目: 实验研究
• 页码范围: 58-63
• 页数: 6页
• 分类号: R114
• 语种: 中文

摘要

目的 构建CYP3 A4基因沉默载体,转染L02肝细胞,建立CYP3A4沉默细胞株并观察其对三氯乙烯毒性的影响.方法 根据GenBank提供的CYP3A4基因mRNA序列设计合成shRNA,将shRNA连接到pLKO.1-puro中,将已经构建的慢病毒载体对293FT细胞进行转染,收集病毒上清,感染正常L02肝细胞.用嘌呤霉素进行筛选得到CYP3A4沉默细胞株,通过荧光定量PCR和Western blot对细胞株进行鉴定.用不同剂量三氯乙烯对正常L02肝细胞和CYP3A4沉默细胞进行染毒12h,观察凋亡基因(Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9)和癌基因(c-fos、c-myc、K-ras、p53)表达变化.结果 测序证明插入pLKO.1-puro载体的干扰序列与设计的序列一致,荧光定量PCR检测CYP3A4沉默细胞CYP3A4基因表达比正常L02肝细胞下降77.3％,Western blot实验显示CYP3A4沉默细胞CYP3A4蛋白表达水平比正常L02肝细胞下降84.6％.CYP3A4沉默细胞经三氯乙烯染毒后Bcl-2表达水平显著高于L02细胞的表达水平；Caspase-3表达水平无明显改变；Caspase-8仅在TCE高剂量组表达下降；Caspase-9在TCE剂量≥1.0 mmol/L表达水平下降；癌基因c-fos、c-myc、k-ras和p53表达水平都有一定程度下降,部分剂量组存在显著差异(P＜0.05或P＜0.01).结论 三氯乙烯对正常肝细胞和CYP3A4沉默细胞凋亡基因和癌基因表达存在明显差异,提示CYP3A4是三氯乙烯在体内代谢的重要因素,与三氯乙烯毒性存在一定关系.