人自噬相关基因LC3 B原核表达载体的构建及活性检测

• 作者: 冀全博 冯滢滢 叶棋浓 周丽英 徐小洁 李玲 杜楠 梁迎春 王涛 郭靖 黄蓉
• 来源期刊: 军事医学
• 学科: 医学
• 关键词: 人LC3B基因 原核表达 纯化 自噬
• 年，卷（期）: 2014,（11）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 867-870
• 页数: 4页
• 分类号: R392.12|Q78
• 字数: 2947字
• 语种: 中文
• DOI: 10.7644/j.issn.1674-9960.2014.11.007

摘要

目的：构建带GST标签的人LC3B基因原核表达载体，得到GST-LC3B重组质粒并纯化出GST-LC3B融合蛋白，体外检测并证实该蛋白的生物学活性。方法利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出LC3B基因的编码序列，将该序列插入到pGEX-KG载体中，得到GST-LC3B重组质粒，转化大肠杆菌Rossate，经小量诱导后利用GST-Sepharose 4B亲和珠纯化GST-LC3B融合蛋白，通过SDS-PAGE电泳和Western印迹方法进行检测，GST pull-down技术证实其生物学活性。结果利用PCR技术从人乳腺文库中成功扩增得到大小约400 bp的目的基因片段，插入pGEX-KG载体中得到GST-LC3B质粒，经双酶切鉴定及测序结果表明重组质粒构建成功；转化Rossate菌并小量诱导，表达鉴定成功后纯化得到相对分子质量（ Mr）约为40×103的目的蛋白；GST pull-down技术检测出GST-LC3B融合蛋白可以和Atg4B蛋白在体外作用，具有较好的生物学活性。结论成功构建了人自噬相关基因LC3B的原核表达产物，为进一步研究LC3 B在自噬中的作用机制奠定了基础。