结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的真核表达及其牛结核病诊断价值评价

• 作者: 万婷 单法 孟闯 徐正中 时振华 焦新安 陈祥
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 关键词: 结核分枝杆菌 培养滤液蛋白10(CFP10) 早期分泌抗原靶6蛋白(ESAT6) 牛结核病 γ-干扰素(IFN-γ)释放实验
• 年，卷（期）: 2015,（2）
• 所属期刊栏目: 研究资源与技术改进
• 页码范围: 267-273
• 页数: 7页
• 字数: 5257字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2015.02.015

摘要

本研究旨在利用毕赤酵母(Pichia pastoris)系统融合表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的培养滤液蛋白10(culture filter protein 10,CFP10)和早期分泌抗原靶6蛋白(earlier secreted antigen target 6,ESAT6),并评价其作为牛结核病外周血γ-干扰素(interferon gamma,IFN-γ)体外释放实验特异性刺激剂来诊断牛结核病的应用潜能.通过PCR扩增cfp1 0-esat6融合基因,构建pPICZα A-(cfp10-esat6)重组质粒,电转化毕赤酵母GSll5,添加甲醇至终浓度1.0％,诱导3d,取培养上清进行SDS-PAGE分析,镍离子金属螯合亲和层析柱纯化目的蛋白,Western blot分析重组蛋白的免疫反应性;取纯化的融合蛋白CFP10-ESAT6作为刺激剂用于牛结核病外周血IFN-γ体外释放实验,评价其牛结核病诊断价值.结果表明,目的蛋白(33kD)被成功分泌表达,该融合蛋白与抗CFP10、ESAT6、组氨酸标签和c-Myc4种单抗均发生特异性反应,具有较好的免疫反应性.165份奶牛外周血样品的IFN-γ检测结果表明,CFP 10-ESAT6融合蛋白与结核菌素纯蛋白衍生物(purified protein derivative,PPD)作为刺激剂,二者阳性符合率为82.3％,阴性符合率为78.8％.本研究利用酵母表达系统成功表达CFP10-ESAT6融合蛋白,并表现出更高的生物学活性,在牛结核病外周血IFN-γ体外释放实验中可作为候选刺激剂,并能克服混合感染导致的PPD漏检问题,从而进一步提高检测的敏感性和特异性.