基础型无启动子基因打靶载体pMCS-IEN的构建及初步检测

• 作者: 云亭 刘东军 刘慧 塔娜 旭日干 李荣凤 梁浩 赵宇航 韩雪洁
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 关键词: 基因打靶 无启动子基因打靶载体 融合蛋白 转染 绿色荧光蛋白
• 年，卷（期）: 2015,（7）
• 所属期刊栏目: 研究资源与技术改进
• 页码范围: 973-980
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2015.03.015

摘要

基因打靶是一项以DNA同源重组为基础,在基因水平上进行定向可遗传性修饰的新型分子生物学技术.无启动子基因打靶技术的建立,对于提高基因定点整合效率以及外源基因的正确表达非常重要.本实验通过PCR技术对pIRES2-EGFP中的neo'基因片段进行扩增,并在其上下游增加BamH Ⅰ和BglⅡ的限制性酶切位点.将得到neo'基因片段连接至载体pMD19-T simple Vector上,命名为pMD-neo.用BamH Ⅰ和BglⅡ对pMD-neo与pEGFP-C1进行酶切,连接目的片段后获得中间质粒pEGFP-neo.随后使用Bsp1407 Ⅰ和SfiⅠ对pEGFP-neo和pIRES2-EGFP进行酶切、连接构成另一中间质粒pIRES-EGFPneo.通过BamH Ⅰ与Mlu Ⅰ对pIRES-EGFPneo和pMD-MCS进行酶切,连接目的片段后得到最终的基础型无启动子打靶载体pMCS-IEN.将PGK启动子连入用于克隆上游同源臂的多克隆位点中,并转染Hela细胞对载体进行检测.结果表明,基础型无启动子基因打靶载体上的筛选标记基因可以富集具有G418抗性且绿色荧光表达阳性的细胞克隆,具有较好的生物学活性.本研究为利用基因打靶技术制作转基因动物提供了比较便利、高效的方法策略.