利用CRISPR/Cas9系统高效敲除斑马鱼lncRNA基因启动子区

• 作者: 刘洋洋 刘菲菲 宋成义 杨哲 杨祎擎 田净净 耿拓宇 韩笑 高波
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 生物学
• 关键词: CRISPR/Cas9 向导RNA (gRNA) 长非编码RNA (lncRNA) 显微注射 Nondret002679 斑马鱼
• 年，卷（期）: 2016,（5）
• 所属期刊栏目: 研究论文与报告
• 页码范围: 649-656
• 分类号: Q812
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2016.05.003

摘要

斑马鱼(Danio rerio)长非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)基因Nondret002679与人(Homo sapiens)肿瘤相关基因间长非编码RNA682基因LNC-PHOX2B-2具有同源序列.本研究以斑马鱼为模型,利用成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列关联蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)系统,敲除预测的Nondret002679基因启动子区以沉默Nondret0026 79基因的表达,研究IncRNA基因Nondret0026 79在斑马鱼中的调控功能.首先利用启动子区上下游序列设计靶向不同位点的向导RNA(guide RNA) gR1、gR2、gR3、gR4、gR5和gR6.人工合成gRNA转录模板,体外转录为gRNA,与Cas9 mRNA一起显微注射到斑马鱼卵中.PCR鉴定28尾2月龄斑马鱼发现,11尾发生敲除,敲除率为39％.繁殖启动子区敲除的杂合鱼,获得33尾F1代,经鉴定有6尾F1斑马鱼启动子区缺失,其中3尾缺失是在两条同源染色体上.该初步研究表明,CRISPR/Cas9系统可高效敲除lncRNA基因的启动子区,并且这种敲除可以遗传至下一代,为研究lncRNA功能提供了一个有效的基因编辑工具.