飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的表达及酶学特性分析

• 作者: 宋慧芳 张建珍 李应龙 马恩波
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 飞蝗 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG) 几丁质降解 蛋白表达 酶学特性
• 年，卷（期）: 2016,（21）
• 所属期刊栏目: 植物保护
• 页码范围: 4140-4148
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.21.008

摘要

[目的]β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetylglucosaminidase,NAG)是昆虫几丁质降解过程中的重要酶类.研究旨在利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统获得高纯度LmNAG1蛋白并对其酶学特性进行分析,探究该酶在飞蝗(Locusts migratoria)生长发育过程中的生物学功能,为飞蝗绿色防控分子靶标研发提供理论与实践依据.[方法]根据mNA G1的cDNA全长序列(GenBank:JX888720.1)设计包含酶切位点BanI、Hind III和6×His标签的引物.采用PCR技术扩增包含开放阅读框的目标片段,双酶切后连接至pFastBacTW-Dual载体上.将重组质粒转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,通过Tn7转座子把目的基因转座到杆状病毒基因组上,用蓝白斑结合抗生素筛选.挑取白斑用pUC/M13引物来扩增目的条带,挑选带目的基因全长的重组杆状病毒质粒(baculovirus plasmid,Bacmid).用转染试剂将重组Bacmid转染至草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)卵巢细胞系Sf9中,72 h内连续观察细胞形态,当出现感染迹象后收集细胞,离心,取上清得到P1代重组病毒粒子.用P1代病毒粒子去感染Sf9细胞,裂解并提取蛋白,Western blot检测目的蛋白是否成功表达.之后大量感染Sf9细胞,提取蛋白,利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱和阴离子交换柱Q对重组蛋白进行纯化,取最纯的馏分用Bradford法测定蛋白浓度.采用4MU-G1cNAc为底物对重组目的蛋白LmNAG1的动力学参数、最适温度和最适pH进行测定.[结果]克隆得到包含1 845 bp LmNAG1全长的pFastBac-LmNAG1重组质粒,酶切验证与目标条带一致.将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞中,PCR扩增挑选出纯白斑,成功将LmNAG1全长序列构建到杆状病毒基因组上.将重组Bacmid转染至Sf9细胞,72 h后在显微镜下观察可见细胞膨大,边不规则等感染迹象.离心收集重组病毒粒子感染新的Sf9细胞,72 h后收集细胞,Western blot检测发现在67 kD附近有明显条带,与LmNAG1的理论分子量一致,获得带6×His标签的融合蛋白.大量感染收集细胞提取蛋白,经Ni-NTA琼脂糖层析纯化,进一步透析除盐后用阴离子交换柱Q二次纯化,得到了高纯度的目的蛋白.用Bradford法测定最纯的E3组分的蛋白浓度为0.057 μg·μL-1.体外活性测定结果表明LmNAG1的最适pH为8.0,且在pH 6.0-8.0范围内具有较高的稳定性;LmNAG1的最适温度为40℃,在40℃以下具有很高的稳定性,当温度高于45℃时热稳定性迅速下降;采用4MU-G1cNAc为底物测得LmNAG1具有水解β-1,4糖苷键的活性,可以释放出4MU,它的动力学参数五值为(0.28±0.02) mmol.L-1,Kat值为(902.88±38.15)s-1.[结论]成功获得高纯度且具活性的LmNAG1蛋白,其可水解β-1,4糖苷键连接的几丁质寡糖,与已知昆虫NAG1具有相似的生物学功能,即参与几丁质的降解.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	马恩波	山西大学应用生物学研究所	170	2032	22.0	34.0
3	张建珍	山西大学应用生物学研究所	75	561	13.0	19.0
5	宋慧芳	山西大学应用生物学研究所	1	9	1.0	1.0
14	李应龙	山西大学应用生物学研究所	1	9	1.0	1.0