利用Bac-to-Bac杆状病毒系统超量表达家蚕 let-7簇microRNAs

• 作者: 何婷 刘仕平 吴小燕 夏庆友 尹权 王伟 黄亚玺
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 家蚕 微小RNA let-7簇 杆状病毒表达系统 过量表达
• 年，卷（期）: 2016,（3）
• 所属期刊栏目: 畜牧?兽医?资源昆虫
• 页码范围: 581-592
• 页数: 12页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.03.016

摘要

【目的】利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统超量表达家蚕（Bombyx mori）let-7簇（cluster）microRNAs：bmo-let-7、bmo-miR-100和bmo-miR-2795，为研究家蚕microRNA的功能提供参考。【方法】克隆家蚕let-7 miRNA簇（bmo-let-7 cluster，bmo-let-7-C）上各miRNA前体(pri-let-7、pri-miR-100与pri-miR-2795)和bmo-let-7-C全长序列，以红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP)基因为报告基因，昆虫细胞表达载体pFastBac1为穿梭载体，通过Tn7转座子把目的基因和报告基因转座到杆状病毒A. californica nucleopolyhedrovirus (AcNPV)基因组上，获得各重组杆状病毒质粒（recombinant baculovirus plasmid，rBacmid）：Bac-let-7、Bac-miR-100、Bac-miR-2795和Bac-let-7-C。将重组Bacmid转染草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）卵巢细胞系Sf9，72 h后用荧光显微镜检查红色荧光蛋白信号，荧光定量PCR检测miRNAs的表达。对转染的Sf9细胞进行离心、收集上清液，获得具感染力的重组病毒，用于侵染新培养的Sf9细胞和注射家蚕幼虫个体，72 h后用荧光显微镜检查红色荧光蛋白信号，荧光定量PCR检测miRNAs的表达。【结果】成功将bmo-let-7-C上各miRNA前体和bmo-let-7-C全长序列构建到杆状病毒基因组上，获得了各miRNA及bmo-let-7-C的过量表达载体。将各重组过量表达载体分别转染草地贪夜蛾细胞系Sf9，72 h后在显微镜下观察到了红色荧光蛋白信号，荧光定量PCR检测结果表明各miRNA显著过量表达；通过离心收集的各miRNA重组过量表达病毒粒子感染新培养的Sf9细胞72 h后检测到了更强的红色荧光蛋白信号，定量PCR结果表明各miRNA均显著过量表达。将各miRNA的重组病毒注射到家蚕5龄1 d幼虫体内后，均能显著超量表达相应miRNA，但注射Bac-let-7-C后只有miR-2795显著过量表达，并有明显的组织差异性，在丝腺中没有过量表达，在脂肪体、血液和中肠中显著过量表达。【结论】利用杆状病毒过量表达系统在草地贪夜蛾细胞系Sf9和家蚕个体中超量表达了家蚕let-7簇miRNAs，为研究家蚕let-7簇和其他miRNAs的产生机制和功能提供了参考。