乳酸菌表达CRISPR gRNA载体的构建与鉴定

• 作者: 朱羿龙 李昌 杜寿文 潘荣荣 王茂鹏 荣凤君 邸洋 郭焱 金宁一
• 来源期刊: 生物技术
• 学科: 生物学
• 关键词: 乳酸菌 基因编辑 重组表达质粒 gRNA CRISPR
• 年，卷（期）: 2017,（1）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 9-16
• 页数: 8页
• 分类号: Q785
• 语种: 中文
• DOI: 10.16519/j.cnki.1004-311x.2017.01.0002

摘要

[目的]构建并筛选重组gRNA(向导RNA)表达质粒pSJCR-LDH和pSJCR-C9PX,并对gRNA在乳酸菌中的表达进行鉴定.[方法]通过PCR技术扩增复制子SH71、氯霉素抗性基因CM和gRNA表达盒片段.将CM片段分别与gRNA表达盒进行融合,再与SH71复制子进行无缝克隆.通过转化,构建重组质粒pSJCR-LDH和pSJCR-C9PX.应用PCR、RT-PCR、Real-Time PCR对重组质粒进行鉴定,gRNA表达验证及拷贝数检测.[结果]PCR及RT-PCR结果显示获得169 bp大小目的条带,表明获得重组质粒载体且该gRNA表达载体在植物乳杆菌WCFS1株、CGMCC1.557株、乳酸乳球菌MG1363株中均成功表达,绝对荧光定量PCR检测获得LDH-gRNA标准曲线为y=-3.480logX+45.34,扩增效率为93.8％;C9PX-gRNA标准曲线为y=-3.327logX+ 37.07,扩增效率为99.8％.[结论]为利用CRISPR基因编辑技术在乳酸菌中进行基因操作奠定基础,为乳酸菌载体构建提供方法.