Pichia pastoris X-33 △GT2缓解甘油对AOX1的阻遏并用于外源蛋白的高效表达

• 作者: 刘秀霞 张震阳 战春君 李翔 杨艳坤 白仲虎
• 来源期刊: 中国生物工程杂志
• 学科: 生物学
• 关键词: 巴斯德毕赤酵母 甘油转运体 GT2 甘油阻遏 基因敲除
• 年，卷（期）: 2017,（1）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 38-45
• 分类号: Q815
• 语种: 中文
• DOI: 10.13523/j.cb.20170106

摘要

巴斯德毕赤酵母是甲醇酵母,作为应用最广泛的真核表达系统之一,在以甲醇为唯一碳源时可以利用醇氧化酶启动子PAOX1进行外源蛋白的表达,但是这一过程会被甘油阻遏.近几年有研究表明,甘油转运体不仅有运输甘油的功能,还与甘油、甲醇的代谢有一定的联系.目的:构建了甘油转运体GT2 (PAS_chr3_1076)缺失菌株P.pastoris X-33 △GT2,研究该菌株的甘油去阻遏效应和在不同碳源培养基中诱导PAOX1启动子驱动外源蛋白的表达水平.方法:构建以甲醇诱导型启动子PAOX1调控外源基因EGFP的表达载体PAOX1-EGFP,经酶线性化后电转野生型菌株P.pastoris X-33获得重组菌株x-EGFP;通过同源重组的方法敲除GT2基因,获得△GT2-EGFP敲除菌株;以△GT2-EGFP和X-EGFP为出发菌株,在甘油、甲醇,以及甘油甲醇混合为碳源诱导醇氧化酶AOX1及绿色荧光蛋白EGFP的表达和生长情况,并检测在以甘油为唯一碳源时,胞外的甘油含量.结果:在以甘油甲醇混合碳源培养时,突变体△GT2-EGFP菌株中AOX1单位酶活比野生型菌株高出近35％,单位荧光强度要高出近70％;在以甘油为唯一碳源时,X-EGFP最终收获时的生物量比△GT2-EGFP多,且发酵液中甘油含量相对较少;以混合碳源培养时△GT2总外源蛋白表达水平最高.结论:实验表明,GT2参与甘油的吸收与代谢,△GT2突变株可在一定程度上解除甘油对甲醇的代谢抑制,暗示甘油转运体与PAOX1相关,且基于此研究结果有望优化出更高效的酵母表达系统.