应用同源重组技术快速构建乙型流感M蛋白通用疫苗的表达载体

• 作者: 伍胤杰 史小军 廖国阳 李卫东 李开伟 杨伟 赵卫中 郑俊杰 郑勇 钏鸿云 高承刚
• 来源期刊: 西部医学
• 学科: 医学
• 关键词: 同源重组 表达载体 乙型流感病毒 快速克隆
• 年，卷（期）: 2017,（8）
• 所属期刊栏目: 基础医学研究
• 页码范围: 1058-1062
• 页数: 5页
• 分类号: Q786|R392.7
• 字数: 3122字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1672-3511.2017.08.006

摘要

目的 应用同源重组技术快速构建pUC57和乙型流感M基因的表达载体.方法 分析2006～2016年世界卫生组织在北半球推荐使用乙型流感病毒疫苗株的变化趋势和云南省内的优势流行病毒株,筛选4株典型毒株做实验毒株.提取病毒RNA基因组,进行RT-PCR后,胶回收后与线性化的载体pUC57后,在37℃同源重组30min,即完成一步法重组.通过转化大肠杆菌筛选阳性克隆,并对阳性质粒进行PCR、酶切和测序鉴定.将表达产物进行初步纯化后免疫小鼠,经过三次加强免疫后,通过中和实验评价表达产物的免疫效果.结果 平板菌落数计数法获得的同源重组阳性率83.3％,PCR阳性质粒能获得大小正确的目的片段,使用EcoR Ⅰ单酶切后,其大小正确,测序后发现质粒碱基没有发生突变或缺失,序列正确,同源重组技术共计耗时34h.中和实验结果显示,相同谱系内的抗原保护效价在1024,并在不同谱系间的交叉保护在256～512.结论 同源重组技术能在流感通用疫苗的上游开发环节中快速、高效的构建重组质粒,表达产物能够诱导小鼠产生良好的免疫保护效果.