大鼠靶向α7nAchR基因shRNA真核表达载体及重组腺病毒构建

• 作者: 任妍林 巩静 徐丽君 方珂 王定坤 王开富 董慧 邹欣 陆付耳
• 来源期刊: 华中科技大学学报（医学版）
• 学科: 医学
• 关键词: α7nAchR shRNA 基因干扰 重组质粒 重组腺病毒
• 年，卷（期）: 2017,（4）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 374-379
• 页数: 6页
• 分类号: R34
• 字数: 5037字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3870/j.issn.1672-0741.2017.04.002

摘要

目的 构建大鼠烟碱样乙酰胆碱受体α7亚型(α7nAchR)基因短发夹RNA(shRNA)真核表达载体.方法 设计并合成编码α7nAchR基因shRNA的DNA模板引物AY318、AY857、AY444+559、AY318+857,并分别与线性化的质粒载体pGenesil-1.1、pGenesil-1.4、pGenesil-1.2,pGenesil-1.3连接,以构建可以编码1条α7nAchR基因shRNA和编码2条α7nAchR基因shRNA的重组质粒载体;重组质粒载体感染感受态的DH5a细胞,提取细菌质粒进行特定酶切,并用1%的琼脂糖凝胶电泳以鉴定重组质粒是否构建成功;用LR体外同源重组法将AY318、AY444+559、AY857 shRNA表达框分别从重组质粒pGenesil转移至腺病毒pGSadeno质粒表达载体上,构建重组腺病毒质粒;用相同的方法感染DH5a细胞,并鉴定重组腺病毒pGSadeno质粒是否构建成功;提取线性化的重组腺病毒DNA并转染包装细胞HEK293,经放大培养获得滴度为1.0×1010pfu/mL的重组腺病毒上清;将重组腺病毒感染大鼠GH3垂体瘤细胞,以PCR反应鉴定重组腺病毒载体的α7nAchR基因干扰效果.结果 通过酶切片段及其大小,初步判断AY318、AY857、AY444+559、AY318+857 shRNA成功重组入质粒载体,重组腺病毒pGSadeno-shRNA包装成功;重组腺病毒感染HEK293细胞,在荧光显微镜下有绿色荧光蛋白表达;重组腺病毒感染GH3细胞后α7nAchR mRNA表达显著减少,且pGSadeno-AY857 shRNA干扰效果最明显(85%).结论 具有感染力和干扰大鼠α7nAchR基因表达的shRNA真核表达载体构建成功,且pGSadeno-AY857 shRNA具有最强的基因干扰效果.