应用酵母双杂交技术筛选和验证与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白

• 作者: 付凯飞 刘晓丹 吴成林 周丽君 杜丽 王欲晓
• 来源期刊: 中华放射医学与防护杂志
• 关键词: 酵母双杂交 DNA依赖蛋白激酶的催化亚单位 磷酸化簇 相互作用 免疫共沉淀
• 年，卷（期）: 2017,（6）
• 所属期刊栏目: 放射生物学
• 页码范围: 401-407
• 页数: 7页
• 字数: 4706字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.0254-5098.2017.06.001

摘要

目的 通过酵母双杂交技术筛选与DNA依赖蛋白激酶的催化亚单位(DNA dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)磷酸化簇区域相互作用的蛋白并进行验证.方法 通过酵母双杂交技术,以之前构建的pGBKT7-DPC载体为诱饵,在人肝组织酵母文库中筛选与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白,对筛选出来的阳性酵母细胞克隆进行PCR鉴定、回转验证以及测序分析;构建诱饵蛋白和阳性克隆蛋白的真核表达载体,分别转染至人胚肾293T细胞中,检测诱饵蛋白和阳性克隆蛋白能否正确表达;最后将阳性克隆蛋白与诱饵蛋白共转染至293T细胞中,通过免疫共沉淀实验检测阳性克隆蛋白与诱饵蛋白之间的相互作用.结果 经过两轮酵母双杂交实验筛选得到12个文库质粒克隆,通过PCR鉴定确定7个插入片段长度互不相同的文库克隆,对7个文库克隆进行回转验证得到3个与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白,经测序分析显示分别为MBNL1、SIK2和YY1AP1.成功构建诱饵蛋白和3个阳性克隆蛋白的真核表达载体,且均能够在293T细胞中正确表达.免疫共沉淀实验证实筛选出来的3个阳性克隆蛋白均能够与DNA-PKcs磷酸化簇区域发生相互作用.结论 成功筛选到与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白并进行了验证.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	周丽君	海军总医院中心实验科	37	90	5.0	7.0
2	王欲晓	海军总医院中心实验科	29	62	5.0	5.0
3	刘晓丹	军事医学科学院放射与辐射医学研究所放射生物学北京市重点实验室	32	118	5.0	10.0
4	吴成林	海军总医院中心实验科	10	24	2.0	4.0
5	杜丽	军事医学科学院放射与辐射医学研究所放射生物学北京市重点实验室	18	68	5.0	7.0
6	付凯飞	海军总医院中心实验科	15	26	3.0	4.0