玉米大斑病菌环腺苷酸磷酸二酯酶基因克隆及表达分析

• 作者: 李盼 李贞杨 申珅 董金皋 赵玉兰 郝志敏 韩建民
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 玉米大斑病菌 环腺苷酸磷酸二酯酶 qRT-PCR 基因表达
• 年，卷（期）: 2017,（16）
• 所属期刊栏目: 植物保护
• 页码范围: 3135-3144
• 页数: 10页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.008

摘要

[目的]获得玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)环腺苷酸磷酸二酯酶(cAMP phosphodiesterase,PDE)基因,并分析其在病菌侵染结构发育过程及侵染寄主早期阶段中的表达,为深入探索cAMP信号途径调控病菌致病性的作用机制打下基础.[方法]根据酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、灰霉病菌(Botrytis cinerea),稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、绿僵菌(Metarhizium anisopliae)和黑曲霉(Aspergillus niger)6种真菌PDE基因的保守序列,利用简并引物PCR对基因保守片段进行扩增,结合RACE和Genome Walking技术获得基因全长及其侧翼序列;利用MEGA 5.0软件对PDE蛋白预测编码产物进行多重序列比对,并采用邻近法构建系统发育树;利用GSDS分析基因结构,ProtParam分析理化性质,SOMPA预测二级结构,SMART数据库在线分析保守结构域;收集人造疏水介质诱导下侵染结构发育不同时期以及侵染感病寄主叶片不同时间的玉米大斑病菌材料,利用qRT-PCR技术研究StPDE在病菌侵染结构形成过程中不同阶段的转录水平.[结果]玉米大斑病菌基因组中存在1个高亲和力磷酸二酯酶基因(StH-PDE)和1个低亲和力磷酸二酯酶基因(StL-PDE).其中,StH-PDE全长3 208 bp,包含5个内含子和6个外显子,ORF为2 898 bp.StL-PDE全长5054 bp,包含4个内含子和5个外显子,ORF为3 090 bp.StH-PDE和StL-PDE分别含有保守的Ⅰ型和Ⅱ型cAMP磷酸二酯酶催化结构域.不同的植物病原真菌中PDE同源基因分别呈现出高度的相似性,其中,StH-PDE与Magnaporthe grisea、Cordyceps militari s、Metarhizium acridum等病原真菌的高亲和力磷酸二酯酶基因聚于同一进化支,stL-PDE与Ascochyta rabiri、scedosporium apiospermum、Fusarium oxysporum、Metarhizium album等病原真菌的低亲和力磷酸二酯酶基因聚于相同进化支.人造疏水介质诱导下,与菌丝相比,StH-PDE和StL-PDE在分生孢子中的表达水平均显著上调,其中StH-PDE和StL-PDE分别上调了约2倍和52倍.孢子萌发初期两个基因表达水平显著下调,随着萌发的进行,表达水平缓慢回升,至附着胞形成阶段,基因表达出现了第2次高峰,随后表达水平再次下调.在整个过程中,StH-PDE的最高表达水平则出现在附着胞形成时期,达到了菌丝体中的近7倍、分生孢子中的近2倍,而StL-PDE的表达水平始终低于其在分生孢子中的表达水平.StH-PDE和StL-PDE在病菌侵染寄主过程中的表达水平变化趋势与其在人工疏水介质诱导下的表现基本一致.在孢子萌发早期表达显著下调,随着时间延长,缓慢回升,至接种后18和24 h StH-PDE表达水平上调,超过萌发初期.[结论]在病菌侵染结构发育过程中,StH-PDE和StL-PDE均呈现下调-上调-下调的表达水平变化趋势.StH-PDE在附着胞时期表达水平最高,StL-PDE在分生孢子中的相对表达水平最高.