稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的MDBK细胞系的建立

• 作者: 俞赵荣 刘光清 张成 朱杰 李刚 李永东 杨侃侃 殷冬冬 王元红 王勇 赵长城
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: 小反刍兽疫病毒 受体 Nectin-4 MDBK细胞系 稳定表达
• 年，卷（期）: 2018,（10）
• 所属期刊栏目: 研究资源与技术改进
• 页码范围: 1814-1820
• 页数: 7页
• 分类号: S855.3
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2018.10.020

摘要

小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)是小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)的病原.Nectin-4为PPRV感染宿主上皮细胞的受体.本研究采用合成的Nectin-4基因,构建重组质粒pLOV-eGFP-Nectin-4.将该重组质粒与包装质粒pSPAX2和外膜质粒pMD2.G质粒共转染293T细胞,获得逆转录病毒样颗粒.为了构建稳定表达PPRV受体Nectin-4的MDBK (Madin-Darby bovine kidney)细胞系,将含有逆转录病毒样颗粒的细胞培养上清液感染MDBK细胞,利用嘌呤霉素筛选、纯化,获得了稳定表达Nectin-4蛋白的MDBK细胞,将其命名为MDBK-Nectin-4.pLO V-eGFP-Nectin-4、pSPAX2和pMD2.G三质粒共转染293T细胞后荧光结果表明,慢病毒成功包装.嘌呤霉素对MDBK细胞最小致死浓度检测结果表明,1μg/mL的嘌呤霉素为最佳的筛选工作浓度.RT-PCR检测结果表明,Nectin-4基因能够在MDBK-Nectin-4细胞中转录成mRNA.Western blot检测结果表明,Nectin-4在MDBK-Nectin-4细胞中能够稳定表达.间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)结果表明,表达的Nectin-4蛋白主要分布在细胞膜上.构建的MDBK-Nectin-4细胞系在连续传代至20代,仍然能够稳定表达Nectin-4蛋白,结果表明具有良好的遗传稳定性.PPRV分别感染MDBK细胞与MDBK-Nectin-4细胞系,后者较于前者能够更快地出现细胞病变.该细胞系的建立为深入研究PPRV与受体Nectin-4的相互作用机制,以及临床快速地分离PPRV提供了实验材料.