CRISPR/Cas9介导绵羊成纤维细胞MSTN基因突变系统的构建

• 作者: 周平 唐红 张译元 王立民 罗健 郭延华 魏海霞
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: 绵羊 肌肉生长抑制素基因(MSTN) CRISPR/Cas9 基因突变
• 年，卷（期）: 2018,（8）
• 所属期刊栏目: 研究资源与技术改进
• 页码范围: 1440-1448
• 页数: 9页
• 分类号: S813.8
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2018.08.017

摘要

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)是肌肉生长负调控因子,MSTN基因突变可造成MSTN生物学功能缺陷,从而引起动物的双肌性状.本研究旨在筛选靶向绵羊(Ovis aries)MSTN基因的高效单导向RNA(single-guide RNA,sgRNA),并构建可标记表达载体,以提高CRISPR/Cas9(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)介导的绵羊MSTN基因突变效率.利用Gibson Assembly法将增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)序列与串联表达原件2A序列插入pX330质粒载体中,构建pX330-EGFP质粒载体,并将设计好的12个sgRNA寡核苷酸链以Golden Gate法分别连入pX330-EGFP质粒载体,以构建12个不同的pX330-EGFP-sgRNA质粒表达载体;将构建好的pX330-EGFP-sgRNA表达载体以电转染的方法分别转入12组绵羊成纤维细胞,48 h后提取各组部分细胞基因组,利用SURVEROR分析初选获得3个具有靶向效果的细胞群(T2,T9,Q2),其对应转染质粒为pX330-EGFP-sgRNA;之后分别提取3组细胞中的阳性转染细胞基因组,扩增MSTN基因并进行测序分析,得出sgRNA-T2、sgRNA-T9、sgRNA-Q2的打靶效率分别为40％、40％、60％.本研究通过构建表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的pX330-EGFP-sgRNA表达载体,成功筛选到高效靶向绵羊MSTN基因的sgRNA,并获得准确的编辑效率,为后续其他基因sgRNA的筛选提供了借鉴,并为MSTN基因编辑羊的生产提供科学依据.