Vasorin基因稳定敲除HepG2细胞株的建立及其生物学功能研究

• 作者: 丁红梅 张坦 李少华 李慧 李洁 李达 王超男 白琛俊 耿介 董洁 邵宁生 黄皑雪
• 来源期刊: 生物技术通讯
• 学科: 生物学
• 关键词: CRISPR/Cas9技术 基因敲除 Vasorin(VASN)基因 细胞增殖 细胞迁移
• 年，卷（期）: 2018,（2）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 162-167
• 页数: 6页
• 分类号: Q78
• 字数: 4305字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1009-0002.2018.02.002

摘要

目的:利用CRISPR/Cas9技术建立人Vasorin(VASN)基因稳定敲除的HepG2细胞株,并研究VASN蛋白对细胞增殖和迁移等生物学功能的影响.方法:根据人VASN序列设计向导RNA,将其克隆至表达载体pCas-Guide,获得质粒pCas-gRNA;PCR扩增VASN编码基因左、右同源臂及潮霉素B抗性基因,通过重叠PCR将三者拼接为一条片段,并克隆至载体pBackZero-T,获得质粒pBackZero-T-VASN;上述2种重组质粒共转染HepG2细胞,经潮霉素B筛选,通过基因组PCR、RT-qPCR和Western印迹实验检测VASN基因是否被敲除.利用CCK-8法和Transwell法检测VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力.结果:向导RNA表达质粒pCas-gRNA和DNA供体质粒pBackZero-T-VASN构建成功;基因组PCR结果显示,潮霉素B基因正确重组至VASN基因中;RT-PCR显示VASN mRNA水平显著降低,Western免疫印迹结果显示VASN蛋白表达水平显著降低;VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力比野生型细胞明显减弱.结论:构建了pCas-gRNA和pBackZero-T-VASN质粒,获得了VASN缺失的细胞株,验证了VASN蛋白参与细胞的增殖和迁移过程,为深度探讨VASN的生物学功能及其分子机制奠定了基础.