CaM突变体质粒的构建、表达纯化及活性鉴定

• 作者: 孙雪菲 封瑞 朱正南 李松霖 王蓉蓉 苏敬阳 袁媛 邵冬雪 郝丽英 黄露婷
• 来源期刊: 中国医科大学学报
• 学科: 医学
• 关键词: 钙调蛋白 突变体 质粒 表达纯化 pull-down实验
• 年，卷（期）: 2018,（2）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 97-101
• 页数: 5页
• 分类号: R96
• 字数: 3417字
• 语种: 中文
• DOI: 10.12007/j.issn.02584646.2018.02.001

摘要

目的 制备钙调蛋白(CaM)突变体CaME141G的融合蛋白质粒,并进行蛋白表达、提取纯化和活性鉴定.方法 利用定点突变技术将野生型CaM的第141个氨基酸E(GAG)突变为G(GGG),再将突变体质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,大量培养后诱导其GST融合蛋白表达,GS-4B beads纯化,PreScission protease酶切GST标签,采用Bradford方法测定纯化后蛋白浓度,SDS-PAGE凝胶电泳检测CaME141G蛋白的相对分子量和纯度,pull-down实验鉴定纯化后蛋白的生物活性.结果 提取纯化后的CaME141G蛋白具有较高的浓度和纯度,且能与心肌CaV1. 2钙通道C末端的PreIQ蛋白片段结合,并具有CaME141G蛋白浓度依赖性,提示该蛋白具有与心肌CaV1. 2钙通道结合的能力.结论 成功构建了CaME141G融合蛋白质粒,并获得了纯化后的CaME141G蛋白,为深入研究CaM突变体在心肌CaV1. 2钙通道中的调节作用及其与心血管系统疾病的关系奠定了基础.