钙调蛋白N2和C2突变体载体的构建、表达纯化和鉴定

• 作者: 于佳慧 唐子鉴 孙嘉瑶 晏珊 李墨 杜逸 祝旭东 郝丽英 陈思充 雷帅
• 来源期刊: 中国医科大学学报
• 学科: 医学
• 关键词: 钙调蛋白 N?lobe C?lobe N2 C2 pull?down实验
• 年，卷（期）: 2017,（5）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 401-405
• 页数: 5页
• 分类号: R96
• 字数: 3169字
• 语种: 中文
• DOI: 10.12007/j.issn.0258?4646.2017.05.005

摘要

目的 构建钙调蛋白(CaM)N2和C2突变体的表达性载体,表达纯化并进行活性鉴定,为进一步研究CaM与钙通道片段的相互作用奠定基础.方法 将CaM的N?lobe和C?lobe的cDNA分别与相应的N?lobe和C?lobe的cDNA相连,制备N2和C2突变体的cDNA.将N2和C2的cDNA分别插入pGEX?6p?3载体,并将重组质粒转入E.coli BL21菌株,IPTG诱导转化成功的菌株表达GST融合蛋白,超声破碎法提取,GS?4B beads纯化,SDS?PAGE电泳鉴定目的蛋白相对分子质量及纯度,pull?down实验鉴定活性.结果 酶切鉴定以及DNA测序结果证实重组质粒构建成功;SDS?PAGE电泳图显示突变体蛋白纯度和浓度均较高;pull?down实验结果证明突变体蛋白有生理活性,能与钙通道片段结合.结论 本研究成功构建了N2和C2表达质粒,并提取、纯化了有活性的钙调蛋白N2和C2突变体.