钙调蛋白的N末端和C末端片段载体构建和蛋白制备

• 作者: 于佳慧 唐子鉴 孙嘉瑶 孙胜男 孙雪菲 李墨 杜逸 胡慧媛 邵冬雪
• 来源期刊: 中国医科大学学报
• 学科: 医学
• 关键词: 钙调蛋白 N末端片段 C末端片段 突变体 pull-down 膜片钳
• 年，卷（期）: 2016,（10）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 877-882
• 页数: 6页
• 分类号: R96
• 字数: 3786字
• 语种: 中文
• DOI: 10.12007/j.issn.0258-4646.2016.10.003

摘要

目的 构建钙调蛋白(CaM)的N末端片段(N-lobe)、C末端片段(C-lobe)及其钙离子(Ca2+)结合位点突变体(N-lobe12,C-lobe34)原核表达载体并进行蛋白表达、纯化和活性鉴定.方法 将上述cDNA片段插入PGEX-6p-3质粒载体后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达.利用Glutathione-Sepharose 4B beads进行分离纯化.采用SDS-PAGE检测目的蛋白纯度和相对分子质量,Bradfo rd方法测定纯化后蛋白浓度,GST pull-down方法和膜片钳技术检测纯化后蛋白活性.结果 蛋白高表达,纯化后获得高纯度、高浓度目的蛋白,纯化后蛋白能与Cav l.2型钙通道结合并可恢复已“rundown”心肌细胞膜钙通道的活性.结论本研究成功构建可以表达生物活性蛋白的N-lobe、C-lobe、N-lobe12及C-lobe34原核表达载体,为深入研究CaM的生物学功能奠定了基础.