CRISPR/Cas9介导的prmt3基因敲除对A549细胞的影响研究

• 作者: 彭昌民 朱跃 杨晓明 裴华东 陈亚丽
• 来源期刊: 军事医学
• 学科: 医学
• 关键词: PRMT3 CRISPR/Cas9 非小细胞肺癌 增殖细胞
• 年，卷（期）: 2018,（2）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 119-123,157
• 页数: 6页
• 分类号: R734.2
• 字数: 3639字
• 语种: 中文
• DOI: 10.7644/j.issn.1674-9960.2018.02.009

摘要

目的 利用CRISPR/Cas9技术,构建靶向精氨酸甲基转移酶3(PRMT3)的基因编辑质粒,建立prmt3基因稳定敲除的A549细胞株,检验prmt3基因敲除效率及其对A549细胞增殖的影响.方法 设计靶向prmt3基因的sgRNA序列,将合成的片段克隆到CRISPR/Cas9质粒载体LentiCRISPR中,挑取单克隆进行测序验证.将构建好的重组质粒和空载体分别进行慢病毒包装,并感染A549细胞,利用嘌罗霉素进行筛选获得PRMT3稳定敲除细胞株,Western印迹检测细胞中PRMT3蛋白的敲除效率.将敲除PRMT3的A549细胞进行单克隆分选,分别利用平板克隆形成实验检测PRMT3敲除后细胞增殖能力,平板划痕实验检测其迁移能力,流式细胞技术检测细胞周期的变化,质谱进行蛋白质组学分析,初步筛查PRMT3可能的底物.结果 经测序验证,成功构建了靶向prmt3基因的LentiCRISPR-PRMT3-sgRNA质粒.经Western印迹检测,A549 PRMT3敲除株中PRMT3的蛋白表达水平明显降低.经单克隆分选,成功获得PRMT3完全敲除的A549细胞株.PRMT3敲除导致A549细胞的克隆形成能力明显增强,细胞迁移能力不变,细胞周期发生G2/M期阻滞.进一步用蛋白质组学的方法初步鉴定了PRMT3可能的底物.结论 利用CRISPR/Cas9技术成功构建了PRMT3稳定敲除的A549细胞株,发现PRMT3能调控细胞周期和增殖,并对其分子机制做了初步探索.